Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Summary

Somatik Hücre Nükleer Transferi (SCNT) üzerinden epigenetik yeniden programlama önceden tanımlanmış T hücre reseptör (TCR) özgüllükleri fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu transnuclear fareler, endojen endojen organizatörü kontrol altında lokus karşılık gelen TCR ifade eder.

Abstract

Lenfositler, T hücreleri gibi, belirli bir özgüllük ¹ ile bir alıcı oluşturmak için, genetik V (D) J rekombinasyon uğrarlar. Için transgenik farelerin bir yeniden düzenlenmiştir antijen-spesifik T hücre reseptör (TCR) T hücre gelişimi ve işlevi incelemek için vazgeçilmez bir araç olmuştur. Ancak, bu TCRS genellikle, yüksek afinite ile T hücreleri için kaçınılmaz seçer tekrarlanan antijen stimülasyonu, genellikle uzun vadeli kültürden sonra ilgili T hücreleri izole edilmiştir. TCR Rastgele genomik entegrasyon α-ve β-zinciri ve olmayan endojen rehberleri ifade ekspresyon seviyesi ve kinetik değişimlerine yol açabilir.

Somatik hücre nükleer transferi yoluyla epigenetik yeniden programlama ilgi herhangi bir hücreden embriyonik kök hücreler ve fareler üretmek için bir araç sağlar. Sonuç olarak, epigenetik işaretleri sıfırlanır SCNT bilinen özgüllük T hücreleri uygulandığında, bu genetik V (D) J düzenlenmeleri, SCNT embriyonik kök hücreler (EKH) ve onlardan elde edilen farelerin aktarılır. Toxoplasma gondii karşı önceden tanımlanmış özgüllükleri T hücrelerinin deneysel olarak tanıtıldı genetik değişiklik yapmadan, kendi endojen lokusların spesifik TCR ifade fare modelleri oluşturmak için kullanılabileceğini göstermiştir. Göreli kolaylığı ve hız gibi transnuclear modeller elde edilebilir olan diğer hastalık modelleri yapımı için söz sahibidir.

Protocol

Bu yöntem bildirilen araştırma Kirak ve ark, Bilim 328 (5975), 243-248 (2010) .

1. Donör Hücreleri İzolasyon

Spesifik T ve B hücreleri transnuclear fare modelleri oluşturmak için donör hücreler olarak kullanılmadan önce, fare ilgi bir patojen ile enfekte ya da bir ilgi antijen aşı olmak gerekir. Toxoplasma gondii spesifik CD8 + hücreleri kullanılan olduğundan, aşağıdaki protokolü, kişisel ilgi göre adapte edilebilir, bu hücrelerin ve ihtiyaçlarını üretimi ve izolasyon anlatacağız .

1. Kistler bir fare beyin Homojenat (yaklaşık 40) türetilen BL / 6 H-2 ^b) ve (H-2 ^d sınırlı CD8 + T hücrelerinin izolasyonu sağlayan x Balb / c F1 (B6CF1) fareler, intraperitoneal enjekte edilir.
2. Immün yanıt zirvesinde, enfekte fare ötenazi, dalak izole edilmiş ve 6 ml kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu içeren bir çanak içine yerleştirilmiş.
3. Dalak, buzlu tarafı iki kapak slaytlar kullanarak, dikkatli bir zemin ve eritrosit lizis tamponu oda sıcaklığında 5 dakika inkübe.
4. 14 ml PBS bir hücre süzgeç (40 veya 70 mm) ile, 50 ml şahin tüp ve 300g az 5 dakika santrifüj hücre süspansiyonu filtre.
5. Süpernatantı, hücre pelet, 1.5 ml Eppendorf tüp içine, 1 ml PBS ve transfer tekrar süspansiyon haline getirin. 300g az 5 dakika süreyle santrifüj ve sonra süpernatant kaldırmak.
6. 50 mcL PBS içinde hücre pelletini tekrar ilgi hücre tipi (örneğin CD3, B220, CD8 ve CD4) tanımlamak için floresan etiketli antikorlar eklemek ve floresan MHC-I tetramer (CD4-T hücreleri MHC-II tetramer) yüklü etiketli 4, 30 dakika hücre süspansiyonu ve inkübe ilgi peptid ° C.
7. 1 ml PBS, 300 g, 3 ml PBS tekrar süspansiyon pelet 5 dakika süreyle santrifüj ekleyin ve bir tüp içine bir hücre süzgeç (40 veya 70 mikron) aracılığıyla hücre süspansiyonu filtre.
8. Kapıların sıkı (Şekil 1B) FACSorting gerçekleştirin.

2. Somatik Hücre Nükleer Transferi

Somatik Hücre Nükleer Transferi için birkaç protokol vardır. Metafaz-II tutuklandı oosit kullanımı ve Cytochalasin B. Bu nedenle donör hücreleri kullanarak ikinci mayoz bölünme inhibisyonu G0/G1 aşamasında ihtiyaç vardır nitelendirdi.

1. Oosit hazırlanması
   1. Dişi fareler BDF1 arka plan, 17:00 ve 19:00 arasında fare başına 5IU PMS ile intraperitoneal enjekte edilir.
   2. Yaklaşık 47 saat sonra, her bir fare 5IU HCG ile intraperitoneal enjekte edilir.
   3. HCG enjeksiyonu aynı gün oosit bir kültür çanak (KSOM AA yağ altında damla) hazırlayın ve onları bir kuluçka 37 ° C,% 5 CO _2. Ayrıca, cıva ile onlara yükleyerek SCNT (enükleasyon 7μm ve lenfosit çekirdekleri nükleer transferi için 4 veya 5μm) için gerekli iğneler hazırlar.
   4. Fareler Euthanize ve HCG sonra 13h (yaklaşık 8:00) hakkında siyon hatası izole. HCZB 1-2 damla siyon hatası toplayın.
   5. Tek-tek M2 w / Hyaluronidase içeren bir damla siyon hatası taşıyın. Nick forsepsle dikkatli bir şekilde yumurtalık ve açılan oosit-kümülüs kompleks taşımak. Tüm oosit-kümülüs kompleksleri izole edilmiştir, çanak 37 inkübe ° C sonra
   6. 2-5 dakika (tam zamanlı Hyaluronidase toplu bağlıdır) oosit toplamak sonra HCZB ve plaka KSOM-AA damla içine yıkayın.
2. Oositlerin Enükleasyon
   1. SCNT plaka hazırlamak için bir petri kapağını kullanın. Mikroskop ve mikromanipülatör ayarlayın.
   2. PVP enükleasyon iğne (7 mm), enükleasyon ile başlamadan önce yıkayın.
   3. Enükleasyon için HZCB Cytochalasin B (5 mg / ml) ile bir damla oosit bir grup (10-30) yerleştirin. Line-up yatay oosit (en az 5 dakika) kuluçka.
   4. Bir oosit ve holding iğne önünde yerleştirin. Holding iğne bir vakum uygulanarak yumurtanın sabitleyin. Enükleasyon iğne kullanarak, kromozom-mil-kompleks (CSC, sık sık "çekirdek" olarak da adlandırılır) 03:00 pozisyonda kadar oosit açın.
   5. Piezo-pulse oosit zarar vermeden dikkatlice zona pellusida nüfuz kullanma. Metafaz-II mili bitişik iğne açılış yerleştirin ve vakum uygulamak. "Çekirdek" yavaş yavaş iğne hareket etmelidir ve membran tamamen çıkarıldıktan sonra kendini imzalaması gerektiğini.
   6. KSOM-AA damlalar halinde geri enükleasyon oosit aktarın ve onları birçok kez yıkayın. E tekrarlayınyeni bir grup ile oosit çekirdeklenme adımları. Tüm yumurta enükleasyon veya 11:00 civarına kadar kadar devam edin.
3. Nükleer transfer
   1. Nükleer transferi için, döviz, nükleer transfer iğnesi (4 veya 5 mikron) ve PVP ile yıkayın enükleasyon iğne (7 mikron).
   2. PVP ile bir damla ilgi hücreleri (örneğin CD8 + T hücreleri) koyun, iyice karıştırın ve en az 10 dakika inkübe edin.
   3. HCZB Cytochalasin B (2.5 mg / ml) ile bir damla enükleasyon oositlerin bir grup (10-30) yerleştirin. Line-up oosit yatay nükleer transfer iğnesi kullanarak kuluçka iken (min. 5 dakika).
   4. PVP-hücre süspansiyonu bir donör hücre Pick up-and-out dış zar (membran ve sitoplazmada parçaları görünür olmalı) aşağı kırılmış kadar aspire. Gerekirse bir piezo-darbe uygulanabilir. Bir çekirdek izole edildikten sonra, iğne biraz yukarı taşımak ve 10-30 kadar çekirdekleri almaya devam edin.
   5. Hizalanmış enükleasyon oosit içeren damlasına kadar hareket ettirin. Vakum uygulanarak holding iğnesi bir oosit sabitleyin. Nükleer transfer iğnesi (çekirdekleri uzakta açılması gerekir), zona pellusida bitişik ve iğne zona pellusida geçti kadar piezo-pulse uygulamak yerleştirin. Dikkatlice bir çekirdeği, iğne ucu hareket iğne, iğne ucu 2 / 3 iç kadar oosit içine itmek. Oosit membran biraz iğne, böylece küçük bir negatif basınç uygulayın.
   6. Bir sonraki adım, oosit aslında "açık" olduğu zaman sadece zaman olduğundan çok kritik. Piezo bir tek darbe uygulayın pozitif basınç uygulayarak iğne çekirdeğini dışarı itmek, iğne ucu oosit yaklaşık 1 / 3 olacak şekilde dikkatlice geri çekin ve daha sonra uygulamak negatif basınç ve iğne geri çekmeye devam oosit mühür. Her oosit ile bu adımı yineleyin.
   7. Bir grubun bütün oosit bir çekirdek aldıktan sonra, onlar KSOM-AA medya yıkanmış ve kültürü vardır. Oosit ile bu işlemi tekrarlayın.
   8. Son grup en az 30 dakika KSOM-AA kültürleri edildikten sonra, SrCl2 içeren Ca-ücretsiz aktivasyon medya damlalar halinde SCNT-embriyolar transfer edilir.
   9. Aktivasyon 6 saat sonra, pseudo-pronuclei miktarı (ÖNYTRLK) pozitif SCNT-embriyolar belirlenir. Embriyoların blastosist aşamasına ulaşana kadar sonra yıkanmış ve KSOM-AA kültür ek 3.5 gün düşer.
   10. İlaçlar ya da tercih kimyasallar (trichostatin olarak A) aktivasyon ve kültür ortamı eklenebilir.

Embriyonik kök hücrelerinin, 3.Derivation

SCNT-blastosist pseudo-hamile kadın (doğrudan ya da bir adım klonlama olarak da bilinir) içine aktarmak için ya da (aynı zamanda dolaylı ya da iki adım klonlama olarak da bilinir) embriyonik kök hücreleri elde etmek için kullanılabilir. Çok daha ES hücreleri oluşturmak için etkili olduğundan, biz iki adım prosedürü seçin. 5. bölümde açıklandığı gibi, bilim adamı doğrudan klonlama ilgilenen durumda blastosist pseudo-hamile kadınlar doğrudan transfer edilebilir.

Embriyonik kök hücrelerinin türetme açıklayan birçok protokol vardır. Burada açıklanan bir besleyici hücreler ve fetal buzağı serumu kullanan standart bir teknik.

1. ES hücre derivasyon için nükleer transferinden sonra ikinci gün, 96-U-plaka hazırlamak.
2. 96-U-plaka her kuyuya en az 10 dakika boyunca inkübe Jelatin, 100 mcL ekleyin ve daha sonra kaldırmak.
3. Çözülme besleyici hücreler ve tekrar süspansiyon ESD orta göre hacmi, 10 ml ESD orta ve hücre süspansiyonu 200 mcL 25 cm ^{2 lik} bir alana denk örneğin besleyici hücreler yeniden süspanse jelatin ile tedavi edilen her birine eklenir.
4. Plaka 37 bir kuluçka ve kültür içine koyun ° C,% 5 CO _2.
5. 3,5 gün sonra, embriyoların blastosist aşamasına olmalıdır.
6. Birkaç damla ES hücre orta ve asidik thyrode kaplama steril bir bakteriyel bir yemek hazırlayın.
7. Blastosist normal ES hücre orta içeren damlalar halinde ilk KSOM-AA damla transfer ve iki kere yıkanır.
8. Asidik thyrode bir damla içine dikkatlice bir grup (5-10 blastosist) blastosist transferi ve orada zona pellusida eriyene kadar tutun.
9. Blastosist, sonra bir damla ile ES orta içine transfer iki kez yıkanır ve sonra besleyici kaplı 96-U-plaka (iyi birine bir blastosist) yerleştirilir.
10. Embriyolar daha sonra onları rahatsız etmeden bir kuluçka 5-7 gün 37 ° C,% 5 CO ₂ kültüre. Bu bir embriyo zaman verirbesleyici tabaka ttach ve bir sonucudur oluşturmak için.
11. Her kuyuya ESD orta kaplama besleyiciler, 24 kuyucuğu hazırlayın, örneğin 12 mL ESD orta ve 50 cm ² besleyici eşdeğer bir tekrar süspansiyon hale getirin ve her kuyuya hücre süspansiyonu 500 mcL ekleyin.
12. Dikkatlice embriyoların 96-U-plaka ESD orta kaldırmak, 250 mcL HEPES (PBS) ile iki kez iyice yıkayın, 50 mcL tripsin ekleyin ve 37 yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe ° C
13. Akıbet tek bir hücre süspansiyonu, 37, 24 plaka ve inkübe içine transfer ° C,% 5 CO ₂ ayrı düşmüş kadar, birden çok kez yukarı ve aşağı Pipet
14. ESC ESC türetme başarılı olursa, koloniler 7-10 gün sonra görünür olmalıdır.

4.Blastocyst enjeksiyon

Blastosist enjeksiyon transgenik fare modelinde her türlü oluşturmak için rutin bir tekniktir. Blastosist sonraki transfer ve pseudo-hamile kadın içine enjeksiyon iyi zamanlanmış gerektiğini belirtmek önemlidir.

1. PMS ve HCG ile Başbakan dişi farelerde bölüm 2.1 'de açıklandığı gibi. HCG enjeksiyonu, erkek fareler (kafes ortalama bir kadın ve bir erkek fare) ile birlikte dişi fareler koymak sonra.
2. Ertesi gün, fişler için kadın kontrol edin. Bu 0.5dpc (Days yazılan cinsel birleşmede) olarak sayılır.
3. Döllenmiş embriyolar, daha sonra, ek olarak 3 gün KSOM-AA bölüm 2.1 'de açıklanan ve kültürlü olarak yumurtalık izole edilir.
4. Blastosist enjeksiyon (3.5dpc) günü ES hücrelerinin hazırlayın.
5. ES hücrelerinin orta çıkarın, 37, HEPES (PBS) ile iki kez yıkamak tripsin ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübe ° C
6. ES orta, bir tabak içinde plaka, 37, 45-60 dakika boyunca inkübe ° C,% 5 _CO 2 besleyici hücreler (besleyici hücreler Embriyonik kök hücrelerin daha hızlı uymak) miktarını azaltmak için. Tripsinize hücreleri ile yeniden süspanse
7. Bir hücre süzgeç (40 veya 70 mikron) ile hücre süspansiyonu bir tüp içine aktarın ve 1000rpm az 5 dakika süreyle santrifüj.
8. Gerektiği kadar buz üzerinde 500 mcL ES orta ve mağaza supernatant, tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın.
9. PVP ve HCZB içeren kaplama damla tarafından, steril bir bakteriyel çanağı kapak hazırlayın.
10. Cıva ile yükleme koymaktan ve PVP ile yıkanarak 15 mikron iğne hazırlayın.
11. Blastosist (10-30 blastosist) bir grup HCZB bir damla içine yerleştirin ve HCZB başka bir damla, 5-50 mcL ES hücre süspansiyonu (konsantrasyonu bağlıdır) ekleyin.
12. ES hücrelerinin (50-100 hücreleri) bir iğne ile toplayınız.
13. Blastosist damlasına kadar hareket ettirin. Blastosist yatay olarak aynı hizaya getirin ve bir vakum uygulanarak holding iğne ile düzeltmek.
14. Iç hücre kütlesi (ICM) 9:00 pozisyonunda kadar bir iğne kullanarak blastosist açın.
15. 3 saat enjeksiyon iğnesi yerleştirin, iğne ucu hiç ES hücrelerinin olmadığından emin olun ve piezo-pulse zona pellusida ve trophectoderm blastocoel içine enjeksiyon iğnesi yoluyla nüfuz kadar geçerlidir.
16. ES hücreleri ICM sopa, böylece birkaç ES hücreleri (5-15 hücreleri) bırakın. Bir grubun tüm blastosist ES hücreleri ile enjekte edilmiş kadar devam edin.
17. Blastosist bir grup tamamlandıktan sonra, KSOM-AA iki kez yıkayın ve tüm blastosist enjekte kadar KSOM-AA ile bir damla tutmak.

5. Embriyo Transferi

Pseudo-hamile kadın içine embriyo transferi, çok dikkatli ve araştırmacı enstitü kurallarına göre yapılması gereken gereken bir cerrahi işlem, temsil eder.

1. , Dişi alıcı fareler uyuşturan, sağ alt kadranda tıraş ve dezenfekte edin.
2. Makas kullanarak cilt açın ve cilt periton ayrı.
3. (Kırmızı nokta) aracılığıyla periton yumurtalık bulun ve yumurtalık yakın periton açık.
4. Bir forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde, yumurtalık kapmak ve rahim çekin.
5. Yaklaşık 10 blastosist kılcal ağız pipet bağlı bir grup seçin.
6. Bir forseps ile Fix rahim içine küçük bir iğne ile küçük bir bütün yumruk ve uterus lümenine blastosist kılcal yerleştirin.
7. Embriyoların rahim içine dikkatlice bırakın ve kılcal kaldırmak.
8. Rahim karın boşluğuna geri itin.
9. Periton kenarları bulun ve birkaç dikiş ile kapatın.
10. Birkaç zımba ile fare cilt kapatın.
11. Post-operatif ağrı, vücut ağırlığının mg başına 5 mg Carprofen yönetmek.

Şekil 1: Somatik hücre nükleerB6CF1 arka planda önceden tanımlanmış T hücrelerinin transferi. Mutlak ve göreli SCNT blastosist elde edilen CD8 + T hücreleri ve embriyonik kök hücrelerinden oluşturulan embriyoların numaraları.

Şekil 2 SCNT embriyonik kök hücreleri enjekte kimerik farelerin Temsilcisi akım sitometri analizi. Kapısı ve sayısı (toplam CD8 + T hücreleri ortalama yüzde) kimerik farelerde spesifik CD8 + T hücrelerinin varlığını gösterir.

Discussion

Biz burada SCNT önceden tanımlanmış özgüllüğü transnuclear farelerde T hücreleri oluşturmak için kullanılan olabilir göstermiştir. Burada gösterilen olmasa da, bu tekniğin de önceden tanımlanmış özgüllük ile B hücreleri transnuclear fareler üretmek için kullanılabilir olmalıdır.

Dikkate alınması gereken önemli bir şey fare zorlanma ve cinsiyet, enfekte veya aşı ve ilgi T veya B hücreleri izole etmek için kullanılır. T ve B hücreleri genel olarak çok düşük bir yeniden programlama verimliliği, istenilen haplotip F1 hibritler kullanmanızı öneririz. Donör hücre aynı zamanda seks belirler Çünkü, biz erkek farelerde T veya B hücre kullanmanızı öneririz. Bu üremek için daha kolay ve hızlı olan erkek farelerin, sadece erkek kimerik farelerin, germline yoluyla TCR veya BCR gönderemediği anlamına gelir.

Birlikte ele alındığında, biz SCNT üzerinden bu epigenetik yeniden programlama immünolojik alan için büyük bir avantaj olacaktır fare modellerinde bir roman türünü oluşturmak için güçlü bir araçtır temsil düşünüyorum.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Red Blood Cell lysis Buffer	Sigma-Aldrich	R7757
Cell strainer	BD Biosciences	REF 352340
Pregnant Mare Serum (PMS)	Calbiochem	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Calbiochem	230734
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272	Type IV-S
KSOM-AA	EMD Millipore	MR-106-D
HCZB	EMD Millipore	MR-173-D	Customized medium
Ca-free medium for activation	EMD Millipore	MR-174-D	Customized medium
SrCl2	Sigma-Aldrich	255521	100mM = 10x
AlbuMAX I	GIBCO, by Life Technologies	11020-021
PVP	MP Biomedicals	102787	Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	500μg/ml = 100x
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552	5mM = 1000x
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310
Holding needle	Humagen	MPH-SM-30
Injection and transfer needles	Humagen	4-15, 7-15, 15-15
Mouth pipette	Sigma-Aldrich	A5177
Scissors	Fine Science Tools	14088-10	or something similar
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	or something similar
Wound Clip Applicator	BD Biosciences	427630
Wound Clips	BD Biosciences	427630
Suture	Ethicon Inc.	K871H
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
FBS	Hyclone	SH30071.03	15%
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100x
Glutamin	MP Biomedicals	101806	200mM = 100x
Non-essential Aminoacids	GIBCO, by Life Technologies	11140050	100x
β-Mercapt–thanol	GIBCO, by Life Technologies	21985-023	5μl in 500ml
LIF	EMD Millipore	ESG1106	1000x
MEK inhibitor	Cell Signaling Technology	9900L	For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM)