Summary
Nous démontrons ici que la reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) peut être utilisé comme un outil pour générer des modèles de souris avec des pré-définis récepteur des cellules T (TCR) des spécificités. Ces souris Transnuclear exprimer la correspondante du TCR de leur locus endogène, sous le contrôle du promoteur endogène.
Abstract
Les lymphocytes, comme les cellules T, subir génétique V (D) J, pour générer un récepteur avec une certaine spécificité 1. Souris transgéniques pour un antigène spécifique réarrangés récepteur des cellules T (TCR) ont été un outil indispensable pour étudier le développement des cellules T et leur fonction. Toutefois, ces TCR sont généralement isolées à partir des cellules T après pertinente à long terme de la culture souvent après stimulation antigénique répétée, qui sélectionne inévitablement des cellules T avec une haute affinité. Aléatoire intégration génomique du TCR α-β et de la chaîne et l'expression du non-endogènes promoteurs peuvent conduire à des variations dans le niveau d'expression et de la cinétique.
Reprogrammation épigénétique par transfert nucléaire de cellule somatique offre un outil pour générer des cellules souches embryonnaires et les souris d'une cellule d'intérêt. Par conséquent, lorsque TNCS est appliquée aux cellules T de spécificité connue, ces génétiques V (D) J réarrangements sont transférés à des cellules souches embryonnaires SCNT (CES) et les souris qui en sont dérivés, tandis que les marques épigénétiques sont réinitialisés. Nous avons démontré que les cellules T avec pré-défini les spécificités contre Toxoplasma gondii peut être utilisé pour générer des modèles de souris qui expriment la TCR spécifique de leur locus endogène, sans modification génétique introduite expérimentalement. La relative facilité et la rapidité avec laquelle ces modèles peuvent être obtenus Transnuclear est prometteuse pour la construction de modèles d'autres maladies.
Protocol
Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. Isolement des cellules du donneur
Avant de T spécifiques ou des cellules B peuvent être utilisés comme les cellules du donneur de générer des modèles de souris Transnuclear, les souris doivent être infecté par un pathogène d'intérêt ou immunisées avec un antigène d'intérêt. Puisque nous avons utilisé les cellules CD8 + spécifiques pour Toxoplasma gondii, le protocole suivant décrira la génération et l'isolement de ces cellules et doit être adaptée en fonction de l'intérêt personnel.
- Les kystes provenant d'un homogénat de cerveau de souris (environ 40) sont injectés par voie intrapéritonéale en BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) des souris, qui permet l'isolement de deux H-2 b et H-2 d restreint cellules T CD8 +.
- Au pic de la réponse immunitaire, la souris infectées est euthanasié, la rate isolés et placés dans un plat contenant 6 cellules ml de sang rouges (RBC) du tampon de lyse.
- En utilisant les côtés givrés de deux diapositives de couverture, la rate, est soigneusement broyé et incubés dans le tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 14 ml de PBS, filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube Falcon de 50 ml et centrifuger pendant 5 min à 300g.
- Retirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de PBS et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Centrifuger pendant 5 min à 300g et retirer le surnageant par la suite.
- Reprendre le culot cellulaire dans 50 ul de PBS, ajouter des anticorps marqués par fluorescence pour identifier le type de cellule d'intérêt (par exemple, CD3, B220, CD8 et CD4), et marqué par fluorescence CMH-I tétramère (CMH-II tétramère pour les cellules T CD4) chargée avec le peptide d'intérêt à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
- Ajouter 1 mL de PBS, centrifuger pendant 5 min à 300 g de granulés, remettre en suspension dans 3 ml de PBS, et filtrer les cellules en suspension à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube.
- Effectuer FACSorting en définissant les portes rigoureusement (figure 1B).
2. Noyaux de cellules somatiques
Il ya quelques protocoles de transfert de noyau de cellule somatique. Celle décrite ici fait usage d'ovocytes arrêtés en métaphase II et l'inhibition de la seconde division méiotique utilisant cytochalasine B. Donc les cellules du donneur sont nécessaires, qui sont en phase de G0/G1.
- Préparation des ovocytes
- Des souris femelles BDF1 des antécédents sont injectés par voie intrapéritonéale avec 5IU PMS par souris 17:00-19:00.
- Environ 47 heures plus tard, chaque souris est injecté par voie intra-péritonéale avec HCG 5IU.
- Préparez une boîte de culture (KSOM-AA gouttes sous huile) pour les ovocytes, le même jour que l'injection de HCG et les placer dans une étuve à 37 ° C, 5% de CO 2. En outre, de préparer les aiguilles nécessaires pour SCNT (7μm d'énucléation et 4 ou 5 pm pour le transfert nucléaire de noyaux de lymphocytes) en les chargeant avec le mercure.
- Euthanasier les souris et d'isoler les oviductes environ 13h après l'HCG (environ 8 heures). Recueillir les oviductes de 1-2 gouttes de HCZB.
- Un par un seul mouvement les oviductes dans une goutte contenant M2 w / hyaluronidase. Nick l'oviducte soigneusement avec une pince et déplacer l'ovocyte-cumulus-complexe dans la goutte. Après tout ovocyte-cumulus-complexes ont été isolés, le plat est incubé à 37 ° C.
- Après 2-5 min (le temps exact dépend du lot de hyaluronidase) recueillir les ovocytes, lavez-les à HCZB et la plaque eux dans KSOM-AA gouttes.
- Énucléation de l'ovocyte
- Utilisez le couvercle d'une boîte de Pétri pour préparer la plaque TNCS. Mettre en place le microscope, et le micromanipulateur.
- Lavez l'aiguille énucléation (7 pm) en PVP avant de commencer avec une énucléation.
- Pour l'énucléation, place un groupe d'ovocytes (10-30) dans une goutte d'HZCB par la cytochalasine B (5 pg / ml). Alors que l'incubation (min. 5 min) gamme des ovocytes horizontalement.
- Prendre un ovocyte et le placer en face de l'aiguille de maintien. Fixer l'ovocyte à l'aiguille tenant en appliquant un vide. Utilisation de l'aiguille énucléation, tournez l'ovocyte jusqu'à la broche-chromosome complexes (SCC, souvent appelé le «noyau») est en position 03 heures.
- Utilisant des dispositifs piézo-impulsions pénétrer la zone pellucide soin, sans endommager l'ovocyte. Placez l'ouverture de l'aiguille adjacente à la broche métaphase II et appliquer le vide. Le "noyau" devrait se déplacer lentement dans l'aiguille, et la membrane doit se joint une fois qu'il est complètement supprimé.
- Transférer les ovocytes énucléés de nouveau dans les gouttes KSOM-AA, et lavez-les plusieurs fois. Répétez l'eétapes de nucléation avec un nouveau groupe d'ovocytes. Continuez jusqu'à ce que tous les oeufs sont énucléés, ou jusqu'à 11 heures environ.
- Transfert nucléaire
- Pour le transfert nucléaire, l'échange de l'aiguille d'énucléation (7 um) avec une aiguille de transfert nucléaire (4 ou 5 um) et le laver avec de PVP.
- Placez vos cellules d'intérêt (par exemple cellules T CD8 +) dans une goutte avec PVP, bien mélanger et laisser incuber pendant une période minimale de 10 min.
- Placer un groupe d'ovocytes énucléés (10-30) dans une goutte d'HCZB par la cytochalasine B (2,5 pg / mL). Alors que l'incubation (min. 5 min) gamme ovocytes horizontalement en utilisant l'aiguille de transfert nucléaire.
- Ramassez une cellule donneuse de la suspension de PVP-cellulaire et l'aspirer au-and-out jusqu'à ce que la membrane externe est en panne (des fragments de la membrane et le cytosol doit être visible). Si nécessaire, un piézo-impulsions peuvent être appliqués. Une fois un noyau a été isolé, déplacez-le un peu dans l'aiguille, et de continuer à ramasser des noyaux jusqu'à ce que vous avez 10-30.
- Déplacer vers la goutte contenant les ovocytes énucléés alignés. Fixer un ovocyte à l'aiguille tenant en appliquant un vide. Placez l'aiguille de transfert nucléaire (les noyaux doivent être éloignées de l'ouverture) adjacent à la zone pellucide et appliquer piézo-impulsions jusqu'à ce que l'aiguille a traversé la zone pellucide. Soigneusement passer un noyau à la pointe de l'aiguille, enfoncer l'aiguille dans l'ovocyte jusqu'à la pointe de l'aiguille est de 2 / 3 à l'intérieur. Appliquez une petite pression négative, de sorte que d'un peu de la membrane ovocytaire est dans l'aiguille.
- La prochaine étape est très critique, car c'est le seul moment où l'ovocyte est réellement «ouvert». Appliquer une seule impulsion de piézo, poussez le noyau de l'aiguille en appliquant une pression positive, soigneusement retirer l'aiguille pour que la pointe est d'environ 1 / 3 dans l'ovocyte, puis appliquer une pression négative et de continuer à reculer l'aiguille joint l'ovocyte. Répétez cette étape avec chaque ovocyte.
- Après tout ovocytes d'un groupe ont reçu un noyau, elles sont lavées et cultivées dans KSOM-AA médias. Répétez cette procédure avec tous les ovocytes.
- Après le dernier groupe a été cultures dans KSOM-AA pour un minimum de 30 min, le SCNT-embryons sont transférés dans des gouttes d'activation des médias Ca libre contenant SrCl2.
- Après 6 heures d'activation, le montant de la pseudo-pronuclei (PPN)-positifs TNCS embryons est déterminé. Les embryons sont ensuite lavées et cultivées dans KSOM-AA gouttes pour 3,5 jours supplémentaires jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de blastocyste.
- Les médicaments ou les produits chimiques de choix (comme trichostatine A) peut être ajouté à l'activation et les milieux de culture.
3.Derivation des cellules souches embryonnaires
Les blastocystes TNCS peut être utilisé soit pour les transférer dans des pseudo-gravides (aussi connu comme le clonage direct ou en une seule étape) ou de dériver des cellules souches embryonnaires (également connu comme le clonage indirect ou deux étapes). Comme il est beaucoup plus efficace pour générer des cellules ES, nous choisissons la procédure en deux étapes. Dans le cas où le chercheur est intéressé par clonage direct, les blastocystes peuvent être transférées directement dans la pseudo-gravides comme décrit dans la section 5.
Il ya de nombreux protocoles décrivant la dérivation de cellules souches embryonnaires. Celle décrite ici est une technique standard, qui utilise des cellules nourricières et de sérum de veau foetal.
- Le deuxième jour après le transfert nucléaire, préparer une plaque de 96-U-même pour la dérivation de cellules souches embryonnaires.
- Ajouter 100 uL de gélatine dans chaque puits d'une plaque 96-U-même, incuber pendant un minimum de 10 min, et ensuite il supprime.
- Cellules nourricières Décongeler et remettre en suspension dans un volume en fonction du milieu de l'EDD, par exemple des cellules nourricières équivalent à une surface de 25 cm 2 sont remis en suspension dans 10 ml de milieu ESD et 200 pi de la suspension cellulaire sont ajoutés dans chacun des gélatine bien traités.
- Mettez la plaque dans un incubateur et la culture à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Après 3,5 jours, les embryons doivent être au stade de blastocyste.
- Préparer un plat stériles bactérienne en plaquant un médium quelques gouttes de cellules ES et thyrode acide.
- Les blastocystes sont d'abord transférés de la chute KSOM-AA en gouttes contenant normales moyennes de cellules ES et lavées deux fois.
- Soigneusement le transfert d'un groupe de blastocystes (blastocystes 5-10) en une seule goutte d'acide thyrode et gardez là jusqu'à ce que la zone pellucide a dissous.
- Les blastocystes sont ensuite transférés dans une goutte de moyenne ES, lavées deux fois, puis placé dans le chargeur de revêtement 96-U-même la plaque (un blastocyste dans un puits).
- Les embryons sont ensuite cultivés pendant 5-7 jours dans un incubateur à 37 ° C CO, 5% 2 sans les déranger. Cela donne le temps d'embryon à unttach à la couche d'alimentation, et de former une excroissance.
- Préparer des plaques 24 puits, en placage de mangeoires dans le milieu de l'EDD dans chaque puits, par exemple resuspendre l'équivalent de 50 cm 2 de desserte dans 12 ml moyennes EDD, et ajouter 500 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits.
- Retirer délicatement le support de la plaque ESD 96-U-bien avec les embryons, laver chaque puits deux fois avec 250 uL Hepes (ou PBS), ajouter 50 uL trypsine et incuber pendant environ 5 min à 37 ° C.
- Pipette de haut en bas plusieurs fois, jusqu'à ce que l'excroissance s'est effondré en une suspension à cellule unique, le transfert dans une plaque de 24 puits et incuber à 37 ° C CO, 5% 2.
- Si la dérivation CES a réussi, les colonies ESC doit être visible après 7-10 jours.
D'injection 4.Blastocyst
L'injection de blastocystes est une technique de routine pour générer n'importe quel type de modèle de souris transgénique. Il est important de mentionner que l'injection de blastocystes et le transfert subséquent en pseudo-gravides doit être chronométré bien.
- Premier souris femelles avec PMS et HCG comme décrit dans la section 2.1. Après l'injection de HCG mis les souris femelles avec des souris mâles (une femelle et un mâle de souris par cage).
- Le lendemain, vérifiez les femelles pour les bouchons. Ceci est compté comme 0.5dpc (jours après le coït).
- Embryons fécondés sont ensuite isolés de l'oviducte comme décrit dans la section 2.1, et cultivées dans KSOM-AA pour trois jours supplémentaires.
- Préparer les cellules ES sur le jour de l'injection blastocyste (3.5dpc).
- Retirer moyennes à partir des cellules ES, laver deux fois avec HEPES (ou PBS), ajouter la trypsine et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
- Resuspendre les cellules trypsinisées à moyen ES, plaque dans un plat, et incuber pendant 45-60 min à 37 ° C, 5% de CO 2 pour réduire la quantité de cellules nourricières (cellules nourricières adhèrent plus rapidement que les cellules ES).
- Transférer la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire (40 ou 70 microns) dans un tube et centrifuger pendant 5 min à 1000rpm.
- Retirer le surnageant, la cellule Resuspendre le culot dans 500 uL moyennes ES et de stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
- Préparer le couvercle d'une boîte stérile bactérienne par des gouttes plaquage contenant PVP et HCZB.
- Préparer une aiguille 15 um en chargeant avec le mercure, le plaçant en position et le laver avec de la PVP.
- Placer un groupe de blastocystes (10-30 blastocystes) dans une goutte avec HCZB, et ajouter 50 à 50 uL de suspension de cellules ES (dépend de la concentration) dans une autre goutte de HCZB.
- Ramassez les cellules ES (50-100 cellules) avec l'aiguille d'injection.
- Déplacer à la baisse avec les blastocystes. Alignez les blastocystes horizontalement, et de fixer un avec l'aiguille tenant en appliquant un vide.
- Utilisation de l'aiguille d'injection tourner le blastocyste jusqu'à ce que la masse cellulaire interne (ICM) est à la position 09 heures.
- Placez votre aiguille d'injection à 03 heures, assurez-vous qu'il n'ya pas de cellules ES à la pointe de l'aiguille, et d'appliquer piézo-impulsions jusqu'à ce que l'aiguille d'injection pénètre à travers la zone pellucide et le trophectoderme dans le blastocèle.
- Libérer une cellules ES quelques (5-15 cellules), de sorte que les cellules ES coller à l'ICM. Continuez jusqu'à ce que tous les blastocystes d'un groupe ont été injectées avec des cellules ES.
- Après un groupe de blastocystes est terminée, les laver deux fois dans KSOM-AA et gardez-les dans une goutte avec KSOM-AA jusqu'à ce que tous les blastocystes sont injectés.
5. Transfert d'embryons
Le transfert des embryons dans les pseudo-gravides représente une intervention chirurgicale, qui doit être effectué très soigneusement et selon les directives de l'institut du chercheur.
- Anesthésier souris receveuses femelles, se raser quadrant inférieur droit, et à désinfecter.
- Utiliser des ciseaux ouvrir la peau, et séparé du péritoine de la peau.
- Localisez l'ovaire à travers le péritoine (tache rouge), et d'ouvrir le péritoine à proximité de l'ovaire.
- En utilisant une pince, soigneusement attraper l'oviducte et sortir de l'utérus.
- Procurez-vous un groupe d'environ 10 blastocystes avec un capillaire relié à une pipette bouche.
- Fixer l'utérus avec une pince, faites un tout petit en elle avec une petite aiguille, et insérez le capillaire avec des blastocystes dans le lumen de l'utérus.
- Soigneusement libérer les embryons dans l'utérus, et supprimer vos capillaire.
- Poussez l'utérus dans la cavité abdominale.
- Repérez les bords du péritoine et de le fermer avec quelques points de suture.
- Fermer la peau de la souris avec un peu d'agrafes.
- Pour douleur post-opératoire, administrer 5 mg carprofène par mg de poids corporel.
Figure 1. Noyaux de cellules somatiquestransfert de lymphocytes T pré-défini dans B6CF1 fond. Les chiffres absolus et relatifs des embryons générés à partir des cellules CD8 + T et les cellules souches embryonnaires dérivées de blastocystes TNCS.
Figure 2. Analyse des flux Représentant cytométrie de souris chimériques injecté avec TNCS cellules souches embryonnaires. Porte et le nombre (au total pour cent par les lymphocytes T CD8 +) indique la présence de certaines cellules CD8 + T chez les souris chimériques.
Discussion
Nous avons montré ici que SCNT peut être utilisée pour générer des souris Transnuclear partir des cellules T avec des pré-défini la spécificité. Bien que non représenté ici, la technique devrait également être utilisable pour générer des souris Transnuclear partir de cellules B avec pré-défini la spécificité.
Une chose importante à considérer est la souche et le sexe des souris, qui est infecté ou immunisé et utilisée pour isoler des cellules T ou B de l'intérêt. Comme les cellules T et B ont un rendement très faible reprogrammation en général, nous recommandons l'utilisation d'hybrides F1 haplotype désiré. Parce que la cellule donneuse détermine aussi le sexe, nous recommandons l'utilisation T ou les cellules B de souris mâles. Cela signifie que seuls mâles souris chimériques transmettrait le TCR ou BCR travers la lignée germinale, avec les souris mâles étant plus facile et plus rapide pour se reproduire.
Pris ensemble, nous pensons que la reprogrammation épigénétique par TNCS représente un outil puissant pour générer un nouveau type de modèles de souris, qui sera un grand avantage pour le domaine de l'immunologie.
Disclosures
Un brevet a été déposée.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants à H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, et G. Yap pour des discussions fructueuses et des réactifs. Nous sommes reconnaissants à J. Dausman, R. Flannery, et J. Jackson pour l'aide à la gestion de la colonie de souris. Nous sommes reconnaissants à P. Wisniewski pour FACSorting. EMF a été soutenu par le Programme scientifique sur la frontière de l'homme. RJ a été soutenue par l'Institut national de bourses en santé RO1-HD045022 et R37-CA084198. HLP a été soutenue par des subventions du National Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
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