Summary
हम यहाँ दिखाना है कि दैहिक सेल न्यूक्लियर ट्रांसफर (SCNT) के माध्यम से epigenetic reprogramming करने के लिए एक पूर्व निर्धारित टी सेल (TCR) रिसेप्टर specificities के साथ माउस मॉडल उत्पन्न उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. ये transnuclear चूहों अंतर्जात प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन उनके अंतर्जात बिन्दुपथ से इसी TCR व्यक्त करते हैं.
Abstract
टी कोशिकाओं जैसे लिम्फोसाइटों, आनुवंशिक वी (डी) जम्मू पुनर्संयोजन गुजरना है, एक निश्चित एक विशिष्टता के साथ एक रिसेप्टर उत्पन्न. के लिए ट्रांसजेनिक चूहों एक पुनर्व्यवस्थित प्रतिजन विशेष टी सेल रिसेप्टर (TCR) टी सेल विकास और समारोह का अध्ययन करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण हो गया है. हालांकि, ऐसे TCRs आमतौर पर अक्सर दोहराया प्रतिजन उत्तेजना, जो unavoidably उच्च आत्मीयता के साथ टी कोशिकाओं के लिए चयन के बाद लंबी अवधि संस्कृति के बाद प्रासंगिक टी कोशिकाओं से अलग हैं. यादृच्छिक TCR के जीनोमिक एकीकरण α और β श्रृंखला और गैर - अंतर्जात प्रमोटरों से अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति के स्तर और कैनेटीक्स में बदलाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
दैहिक सेल परमाणु हस्तांतरण के माध्यम से epigenetic reprogramming के लिए ब्याज की किसी भी कोशिका से भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं और चूहों उत्पन्न उपकरण प्रदान करता है. नतीजतन, जब SCNT ज्ञात विशिष्टता की टी कोशिकाओं को लागू किया जाता है, इन आनुवंशिक वी (डी) जम्मू rearrangements SCNT भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) और उन लोगों से प्राप्त चूहों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, जबकि epigenetic निशान रीसेट कर रहे हैं. हमने दिखा दिया है कि Toxoplasma gondii के खिलाफ पूर्व निर्धारित specificities के साथ टी कोशिकाओं के लिए माउस मॉडल है कि प्रयोगात्मक शुरू आनुवंशिक संशोधन के बिना उनके अंतर्जात loci से विशिष्ट TCR व्यक्त उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रिश्तेदार आसानी और गति, जो के साथ इस तरह transnuclear मॉडल प्राप्त किया जा सकता है अन्य रोग मॉडल के निर्माण के लिए वादा धारण.
Protocol
इस विधि में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया था Kirak एट अल, विज्ञान 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. दाता कोशिकाओं के अलगाव
इससे पहले कि विशिष्ट टी या बी कोशिकाओं दाता कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए transnuclear माउस मॉडल उत्पन्न, चूहों के लिए ब्याज की एक रोगज़नक़ के साथ संक्रमित हो या ब्याज की एक प्रतिजन के साथ प्रतिरक्षित की जरूरत है. चूंकि हम CD8 + Toxoplasma gondii के लिए विशिष्ट कक्षों का इस्तेमाल किया है, निम्नलिखित प्रोटोकॉल पीढ़ी और इन कोशिकाओं की जरूरत है और व्यक्तिगत रुचि के अनुसार अनुकूलित किया जा के अलगाव का वर्णन करेंगे .
- एक माउस मस्तिष्क homogenate (40) के बारे में से व्युत्पन्न अल्सर बीएल / x 6 Balb / ग (B6CF1) F1 चूहों, जो दोनों H-2 ख और घ प्रतिबंधित CD8 + टी कोशिकाओं H-2 के अलगाव में सक्षम बनाता है में अंतर peritoneally अंतःक्षिप्त रहे हैं.
- प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के चरम पर, संक्रमित माउस euthanized है, तिल्ली अलग और एक 6 एमएल लाल रक्त सेल (आरबीसी) lysis बफर युक्त पकवान में रखा.
- दो कवर स्लाइड के पाले सेओढ़ लिया पक्षों का प्रयोग, तिल्ली ध्यान से और जमीन आरटी पर 5 मिनट के लिए आरबीसी lysis बफर में incubated.
- 14 एमएल पीबीएस जोड़ें, एक सेल झरनी (40 या 70 सुक्ष्ममापी) के माध्यम से एक 50 एमएल बाज़ ट्यूब और 300g से कम 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में सेल निलंबन फिल्टर.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें, 1 एमएल पीबीएस और हस्तांतरण में सेल गोली एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में resuspend. अपकेंद्रित्र 300g से कम 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला बाद हटायें.
- 50 μL पीबीएस में सेल गोली Resuspend fluorescently लेबल एंटीबॉडी को जोड़ने के लिए ब्याज की कोशिका प्रकार (जैसे CD3, B220, सीडी 8, और CD4) की पहचान, और fluorescently MHC-I (CD4 टी कोशिकाओं के लिए MHC-II tetramer) tetramer लोड लेबल ब्याज की 4 सेल और 30 मिनट के लिए निलंबन सेते पेप्टाइड ° सी. के साथ
- 1 एमएल Pbs, 300 ग्राम 3 मिलीलीटर पीबीएस में, resuspend गोली में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जोड़ें, और एक ट्यूब में एक सेल झरनी (40 या 70 सुक्ष्ममापी) के माध्यम से सेल निलंबन फिल्टर.
- फाटक इसरो की स्थापना (चित्रा 1 बी) के द्वारा FACSorting प्रदर्शन.
2. दैहिक सेल परमाणु स्थानांतरण
दैहिक सेल परमाणु हस्तांतरण के लिए कुछ प्रोटोकॉल रहे हैं. एक वर्णित यहाँ मेटाफ़ेज़ द्वितीय गिरफ्तार oocytes का उपयोग करता है और दूसरा meiotic Cytochalasin बी इसलिए दाता कोशिकाओं का उपयोग कर विभाजन के निषेध की जरूरत है जो G0/G1 चरण में हैं.
- Oocytes की तैयारी
- BDF1 पृष्ठभूमि के स्त्री चूहों 17:00 और 19:00 के बीच 5IU माउस के प्रति पीएमएस के साथ अंतर peritoneally अंतःक्षिप्त रहे हैं.
- के बारे में 47 घंटे बाद, प्रत्येक माउस 5IU एचसीजी के साथ अंतर peritoneally इंजेक्शन है.
- एचसीजी इंजेक्शन के रूप में में एक ही दिन पर oocytes के लिए एक संस्कृति डिश (KSOM ए.ए. तेल के तहत बूँदें) तैयार है और उन्हें एक 37 इनक्यूबेटर में जगह डिग्री सेल्सियस, 5 % सीओ 2. इसके अलावा, उन्हें पारा के साथ लोड हो रहा है SCNT (enucleation और 7μm के लिए 4 या 5μm लिम्फोसाइट नाभिक के परमाणु हस्तांतरण के लिए) के लिए आवश्यक सुइयों तैयार करते हैं.
- चूहों euthanize और एचसीजी के बाद 13h (लगभग 8:00) के बारे में oviducts अलग. HCZB की 1-2 बूंदों में oviducts ले लीजिए.
- एक द्वारा एक एक बूंद युक्त M2 w / hyaluronidase में oviducts ले जाने के. निक एक forcep के साथ सावधानी से oviduct और ड्रॉप में oocyte-मेघपुंज - जटिल कदम. सभी oocyte-मेघपुंज परिसरों को अलग किया गया है, पकवान 37 में incubated है डिग्री सेल्सियस के बाद
- 2-5 मिनट (सटीक समय hyaluronidase के बैच पर निर्भर करता है है) के बाद oocytes इकट्ठा, HCZB और उन्हें KSOM - ए.ए. बूँदें में थाली में धो लो.
- Oocytes की Enucleation
- एक पेट्री डिश के ढक्कन प्रयोग SCNT थाली तैयार है. माइक्रोस्कोप, और micromanipulator सेट.
- PVP में enucleation के साथ शुरू करने से पहले enucleation सुई (7 सुक्ष्ममापी) धो लें.
- Enucleation के लिए, Cytochalasin बी (5 μg / एमएल) के साथ HZCB की एक बूंद में oocytes के एक समूह (1-30) जगह. जबकि (5 मिनट यूके) incubating क्षैतिज लाइन अप oocytes.
- एक oocyte ले लो और पकड़े सुई के सामने यह जगह. एक निर्वात लागू करने के द्वारा पकड़े सुई oocyte ठीक. Enucleation सुई का प्रयोग, (सीएससी, "नाभिक" अक्सर कहा जाता है) गुणसूत्र धुरा जटिल 3 बजे की स्थिति में है जब तक oocyte बारी.
- उपयोग piezo पल्स zona pellucida oocyte को नुकसान पहुँचाए बिना सावधानी से घुसना. मेटाफ़ेज़ द्वितीय धुरी के लिए आसन्न सुई के उद्घाटन प्लेस और वैक्यूम लागू. "नाभिक" धीरे सुई में स्थानांतरित करना चाहिए, और झिल्ली ही सील एक बार यह पूरी तरह से हटा दिया जाता है चाहिए.
- Enucleated oocytes वापस बूँदें KSOM - ए.ए. में, स्थानांतरण और उन्हें कई बार धोने. ई दोहराएँoocytes के एक नए समूह के साथ nucleation कदम. जारी रखें जब तक सभी अंडे enucleated या 11:00 के बारे में जब तक.
- न्यूक्लियर ट्रांसफर
- परमाणु हस्तांतरण के लिए, एक परमाणु हस्तांतरण (4 या 5 सुक्ष्ममापी) सुई और यह PVP साथ धोने के साथ विनिमय enucleation सुई (7 सुक्ष्ममापी).
- PVP के साथ एक बूंद में ब्याज की अपनी कोशिकाओं (CD8 जैसे + टी कोशिकाओं) प्लेस, मिश्रण अच्छी तरह से और 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं.
- Cytochalasin बी (2.5 μg / एमएल) के साथ HCZB की एक बूंद में enucleated oocytes के एक समूह (1-30) रखें. जबकि (5 मिनट यूके) परमाणु हस्तांतरण सुई का उपयोग करके लाइन अप oocytes क्षैतिज incubating.
- PVP सेल निलंबन से एक दाता सेल उठाओ और में और बाहर जब तक बाहरी झिल्ली टूट गया है (झिल्ली और cytosol के टुकड़े दिखाई जानी चाहिए) aspirate. यदि आवश्यक हो तो एक piezo पल्स लागू किया जा सकता है. एक बार एक नाभिक अलग किया गया है, यह एक छोटा सा कदम सुई में, और जारी रखने के ऊपर नाभिक लेने जब तक आप 10-30 है.
- गठबंधन enucleated oocytes युक्त ड्रॉप करने के लिए जाएँ. पकड़े सुई निर्वात लागू करने के द्वारा एक oocyte ठीक. परमाणु हस्तांतरण सुई प्लेस zona pellucida के निकट (नाभिक खोलने से दूर होना चाहिए) और लागू piezo पल्स जब तक सुई zona pellucida के माध्यम से चला गया है. ध्यान से सुई की नोक के लिए एक नाभिक चाल, oocyte में सुई धक्का है जब तक कि सुई की नोक 2 / 3 के अंदर है. एक छोटे से नकारात्मक दबाव लागू करें, ताकि oocyte झिल्ली के एक थोड़ा सुई में है.
- अगले कदम बहुत महत्वपूर्ण है, के बाद से यह केवल समय है जब oocyte वास्तव में "खुला" है. Piezo की एक नाड़ी लागू, नाभिक सकारात्मक दबाव लागू करने के द्वारा सुई के बाहर धक्का, ध्यान से वापस खींच सुई इतना है कि टिप के बारे में 1 / 3 oocyte में है, और तब लागू नकारात्मक दबाव और वापस करने के लिए सुई खींचने के लिए जारी oocyte सील. प्रत्येक oocyte के साथ इस चरण को दोहराएँ.
- के बाद एक समूह के सभी oocytes नाभिक प्राप्त है, वे और धोया KSOM - ए.ए. मीडिया में सुसंस्कृत. सभी oocytes के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
- पिछले समूह के बाद 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए KSOM ए.ए. में संस्कृतियों किया गया है, SCNT - भ्रूण Ca मुक्त सक्रियण SrCl2 युक्त मीडिया की बूंदों में स्थानांतरित कर रहे हैं.
- सक्रियण के 6 घंटे के बाद, छद्म pronuclei की राशि (PPN) सकारात्मक भ्रूण - SCNT निर्धारित किया जाता है. भ्रूण और फिर धो रहे हैं KSOM - ए.ए. में सभ्य अतिरिक्त 3.5 दिनों के लिए बूँदें जब तक वे ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुँच चुके हैं.
- ड्रग्स या रसायनों (जैसे Trichostatin के रूप में) सक्रियण संस्कृति और मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है पसंद की.
भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के 3.Derivation
SCNT blastocysts या तो उन्हें छद्म गर्भवती महिलाओं (भी प्रत्यक्ष या एक कदम क्लोनिंग के रूप में जाना जाता है) में स्थानान्तरण या भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (भी अप्रत्यक्ष या दो कदम क्लोनिंग के रूप में जाना जाता है) प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चूंकि यह अधिक ES कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए कुशल है, हम दो कदम प्रक्रिया का चयन करें. मामले में वैज्ञानिक प्रत्यक्ष क्लोनिंग में रुचि है, blastocysts छद्म गर्भवती महिलाओं में सीधे हस्तांतरित किया जा के रूप में धारा 5 में वर्णित है.
वहाँ कई प्रोटोकॉल भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की व्युत्पत्ति का वर्णन कर रहे हैं. यहाँ वर्णित एक एक मानक तकनीक है, जो फीडर, कोशिकाओं, और भ्रूण बछड़ा सीरम का इस्तेमाल है.
- परमाणु हस्तांतरण के बाद दूसरे दिन, ES सेल व्युत्पत्ति के लिए एक 96 U-अच्छी तरह से थाली तैयार है.
- जोड़ें एक 96 U-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 100 जिलेटिन μL, 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं, और इसे बाद में हटायें.
- पिघलना फीडर कोशिकाओं और ESD माध्यम से एक के अनुसार मात्रा में resuspend, जैसे फीडर 25 2 सेमी की एक क्षेत्र के बराबर कोशिकाओं 10 एमएल ESD मध्यम और सेल निलंबन के 200 μL में resuspended हैं अच्छी तरह से जिलेटिन के इलाज के प्रत्येक में जोड़ा जाता है.
- एक मशीन और संस्कृति में 37 पर थाली रखो ° सी, 5% सीओ 2.
- 3.5 दिनों के बाद भ्रूण को ब्लास्टोसिस्ट चरण में होना चाहिए.
- कुछ बूँदें ES सेल मध्यम और अम्लीय thyrode चढ़ाना द्वारा एक बाँझ बैक्टीरियल पकवान तैयार करें.
- blastocysts पहली बार सामान्य ES सेल मध्यम युक्त बूंदों में KSOM - ए.ए. बूँदें से स्थानांतरित और दो बार धोया.
- ध्यान से अम्लीय thyrode की एक बूंद में blastocysts (5-10 blastocysts) के एक समूह हस्तांतरण और वहाँ रखने के लिए जब तक zona pellucida को भंग कर दिया है.
- blastocysts तो ES मध्यम के साथ एक बूंद में स्थानांतरित कर रहे हैं, दो बार धोया, और फिर फीडर में लिपटे 96 यू अच्छी तरह से थाली (एक अच्छी तरह से में एक ब्लास्टोसिस्ट) में रखा.
- भ्रूण तो 37 °% 5 सी, सीओ 2 में एक मशीन में 5-7 दिनों के लिए उन्हें परेशान बिना संवर्धित. यह एक भ्रूण समय देता हैफीडर परत ttach, और एक परिणाम के रूप में.
- ESD मध्यम में प्रत्येक अच्छी तरह से में चढ़ाना भक्षण द्वारा 24 अच्छी तरह प्लेटें, तैयार है, जैसे 12 एमएल ESD मध्यम में 50 सेमी 2 फीडर के एक बराबर resuspend, और प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 500 μL जोड़ने.
- ध्यान से भ्रूण के साथ 96 यू अच्छी तरह से थाली से ESD मध्यम हटायें, प्रत्येक 250 μL Hepes (या पीबीएस) के साथ दो बार अच्छी तरह से धोने, 50 μL trypsin जोड़ने और 37 पर के बारे में 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- कई बार ऊपर और नीचे पिपेट, जब तक परिणाम के अलावा एक एकल कक्ष निलंबन, 24 अच्छी तरह से और 37 पर थाली सेते में हस्तांतरण °% 5 सी, सीओ 2. में गिर गया है
- यदि ईएससी व्युत्पत्ति सफल रहा था, ईएससी कालोनियों 7-10 दिनों के बाद दिखाई जानी चाहिए.
4.Blastocyst इंजेक्शन
blastocysts के इंजेक्शन ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का किसी भी तरह की उत्पन्न करने के लिए एक नियमित तकनीक है. यह महत्वपूर्ण है उल्लेख है कि blastocysts और छद्म गर्भवती महिलाओं में बाद हस्तांतरण का इंजेक्शन को अच्छी तरह से समय की जरूरत है.
- पीएमएस और एचसीजी के साथ प्रधानमंत्री मादा चूहों के रूप में खंड 2.1 में वर्णित हैं. एचसीजी इंजेक्शन के बाद मादा चूहों नर चूहों (एक महिला और एक पिंजरे प्रति पुरुष माउस) के साथ एक साथ रखा.
- अगले दिन, प्लग के लिए महिलाओं की जाँच करें. इस 0.5dpc (दिनों के बाद सहवास) के रूप में गिना जाता है.
- निषेचित भ्रूण तो के रूप में 2.1 खंड में वर्णित है, और सभ्य KSOM - ए.ए. में अतिरिक्त 3 दिनों के लिए oviduct से अलग कर रहे हैं.
- ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन (3.5dpc) के दिन पर ES कोशिकाओं की तैयारी.
- ES कोशिकाओं से मध्यम निकालें, Hepes या (पीबीएस) के साथ दो बार धोने, trypsin जोड़ने और 37 पर 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- साथ Resuspend trypsinized कोशिकाओं मध्यम ES, एक थाली में थाली, और 37 पर 45-60 मिनट के लिए सेते ° सी, 5% सीओ 2 फीडर कोशिकाओं (फीडर कोशिकाओं ES कोशिकाओं की तुलना में तेजी से पालन) की राशि को कम करने.
- एक ट्यूब में एक सेल झरनी (40 या 70 सुक्ष्ममापी) के माध्यम से सेल निलंबन, स्थानांतरण और 1000rpm पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- 500 μL ES मध्यम और दुकान में सतह पर तैरनेवाला resuspend सेल गोली बर्फ पर जब तक जरूरत निकालें.
- चढ़ाना PVP और HCZB युक्त बूँदें द्वारा एक बाँझ बैक्टीरियल डिश के ढक्कन तैयार करें.
- पारा के साथ लोड हो रहा है, यह स्थिति में रखने और यह PVP से धोने के द्वारा एक 15 सुक्ष्ममापी सुई तैयार है.
- HCZB के साथ एक बूंद में blastocysts (30/10 blastocysts) के एक समूह प्लेस, और HCZB की एक बूंद में 5-50 μL ES सेल निलंबन (एकाग्रता पर निर्भर करता है) को जोड़ने.
- इंजेक्शन की सुई के साथ ES कोशिकाओं (5-10 कोशिकाओं) उठाओ.
- Blastocysts साथ ड्रॉप करने के लिए ले जाएँ. Blastocysts क्षैतिज संरेखित करें, और वैक्यूम आवेदन द्वारा पकड़े सुई के साथ ठीक.
- इंजेक्शन सुई का प्रयोग ब्लास्टोसिस्ट बारी जब तक आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (ICM) 9 बजे की स्थिति में है.
- 3 बजे अपने इंजेक्शन सुई प्लेस, यकीन है कि वहाँ सुई की नोक पर कोई ES कोशिकाओं रहे हैं बनाने के लिए, और लागू piezo नाड़ी इंजेक्शन सुई तक zona pellucida और blastocoel में trophectoderm के माध्यम से प्रवेश.
- कुछ ES कोशिकाओं (5-15 कोशिकाओं) रिलीज, ताकि ES कोशिकाओं ICM के लिए छड़ी. जारी रखें जब तक एक समूह के सभी blastocysts ES कोशिकाओं के साथ अंतःक्षिप्त किया गया है.
- Blastocysts के एक समूह के बाद समाप्त हो गया है, उन्हें दो बार और KSOM - ए.ए. में धो KSOM ए.ए. के साथ एक बूंद में उन्हें रखने के लिए जब तक सभी blastocysts अंतःक्षिप्त रहे हैं.
5. भ्रूण स्थानांतरण
छद्म गर्भवती महिलाओं में भ्रूण के हस्तांतरण के एक शल्य प्रक्रिया है, जो जरूरतों के लिए बाहर बहुत ध्यान से और शोधकर्ता संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार किया जा का प्रतिनिधित्व करता है.
- महिला प्राप्तकर्ता चूहों चतनाशून्य करना, कम सही कोण नापने का यंत्र, दाढ़ी और कीटाणुरहित.
- का प्रयोग कैंची त्वचा को खोलने के लिए, है और त्वचा से पेरिटोनियम अलग है.
- Peritoneum (लाल हाजिर) के माध्यम से अंडाशय का पता लगाएँ, और अंडाशय के करीब निकटता में पेरिटोनियम खुला.
- एक संदंश का प्रयोग, ध्यान से oviduct हड़पने और बाहर गर्भाशय खींच.
- एक केशिका एक मुँह विंदुक जुड़ा के साथ एक समूह के बारे में 10 blastocysts उठाओ.
- एक संदंश के साथ ठीक गर्भाशय, एक छोटी सुई के साथ इसे में एक छोटे से पूरे, पंच और गर्भाशय के लुमेन में blastocysts साथ केशिका सम्मिलित.
- ध्यान से गर्भाशय में भ्रूण जारी है, और अपने केश हटा.
- उदर गुहा में गर्भाशय वापस पुश.
- Peritoneum के किनारों का पता लगाएँ और यह कुछ टांके के साथ बंद.
- माउस के कुछ स्टेपल के साथ त्वचा को बंद करें.
- पोस्ट ऑपरेटिव दर्द के लिए, शरीर के वजन के मिलीग्राम प्रति 5 μg Carprofen प्रशासन.
चित्रा 1 दैहिक सेल परमाणुB6CF1 पृष्ठभूमि में पूर्व - परिभाषित टी कोशिकाओं के हस्तांतरण. CD8 + टी कोशिकाओं और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं SCNT blastocysts से व्युत्पन्न से उत्पन्न भ्रूण की निरपेक्ष और सापेक्ष संख्या.
चित्रा 2 chimeric SCNT भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के साथ चूहों अंतःक्षिप्त के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric विश्लेषण . गेट और संख्या (कुल CD8 + टी कोशिकाओं प्रति प्रतिशत) chimeric चूहों में विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत है.
Discussion
हम यहाँ से पता चला है कि SCNT पूर्व निर्धारित विशिष्टता के साथ टी कोशिकाओं से transnuclear चूहों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि यहाँ दिखाया नहीं, तकनीक भी पूर्व निर्धारित विशिष्टता के साथ बी कोशिकाओं से transnuclear चूहों को उत्पन्न करने के लिए प्रयोग करने योग्य होना चाहिए.
एक महत्वपूर्ण बात पर विचार तनाव और माउस के लिंग, जो संक्रमित है या प्रतिरक्षित और टी या ब्याज की बी कोशिकाओं को अलग किया जाता है. चूंकि टी और बी कोशिकाओं सामान्य में एक बहुत ही कम reprogramming दक्षता है, हम वांछित haplotype F1 संकर का उपयोग करने की सलाह देते हैं. क्योंकि दाता सेल भी सेक्स निर्धारित करता है, हम टी या नर चूहों से बी कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं. इसका मतलब यह है कि केवल पुरुष chimeric चूहों पुरुष प्रजनन के लिए आसान और तेजी से किया जा रहा है चूहों के साथ germline के माध्यम से TCR या BCR संचारित होता है.
साथ में ले ली है, हमें लगता है कि SCNT के माध्यम से कि epigenetic reprogramming एक उपन्यास माउस मॉडल के प्रकार, जो प्रतिरक्षाविज्ञानी क्षेत्र के लिए महान लाभ में से एक होगा उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.
Disclosures
एक पेटेंट दायर किया गया है.
Acknowledgments
लेखकों, एम. एच. Eisen Gubbels, लालकृष्ण वैन Grinsven, ई. गुइल्लें, ए ड्रेक, वी. महाजन, अतारांकित गाओ, और उपयोगी विचार - विमर्श और अभिकर्मकों के लिए जी याप आभारी हैं. हम जे Dausman, आर Flannery, और जे जैक्सन के लिए माउस कॉलोनी के प्रबंधन के साथ सहायता के लिए आभारी हैं. हम पी. Wisniewski FACSorting के लिए आभारी हैं. EMF मानव सीमाओं विज्ञान कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया. आरजे स्वास्थ्य RO1 HD045022 और R37-CA084198 अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. नि: स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
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- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).
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