Summary
Dimostriamo qui che riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) può essere utilizzato come uno strumento per generare modelli di topo con pre-definito recettore delle cellule T (TCR) specificità. Questi topi transnuclear esprimono il corrispondente TCR dal loro luogo endogena sotto il controllo del promotore endogeno.
Abstract
Linfociti, come le cellule T, sottoposti genetica V (D) J ricombinazione, per generare un recettore con una certa specificità 1. Topi transgenici per un riarrangiati antigene-specifici recettori delle cellule T (TCR) è stato uno strumento indispensabile per studiare lo sviluppo delle cellule T e la funzione. Tuttavia, TCR quali di solito sono isolate dalle cellule T rilevante dopo un lungo periodo la cultura spesso a seguito di stimolazione antigenica ripetuta, che seleziona inevitabilmente per le cellule T con alta affinità. Casuale integrazione genomica del TCR α e β-chain e di espressione da non endogena promotori possono portare a variazioni nel livello di espressione e cinetica.
Riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche fornisce uno strumento per generare cellule staminali embrionali e topi da qualsiasi cellula di interesse. Di conseguenza, quando SCNT è applicato alle cellule T di specificità noto, questi genetica V (D) J riarrangiamenti sono trasferite al SCNT-cellule embrionali staminali (ESC) e dei topi che ne derivano, mentre segnali epigenetici vengono azzerati. Abbiamo dimostrato che le cellule T con pre-definiti specificità contro Toxoplasma gondii può essere usato per generare modelli di topo che esprimono il TCR specifico dal loro loci endogene, senza modificazione genetica introdotta sperimentalmente. La relativa facilità e la velocità con cui tali modelli possono essere ottenuti transnuclear promettente per la costruzione di modelli di altre malattie.
Protocol
Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Kirak et al. Science 328 (5975), 243-248 (2010) .
1. Isolamento di cellule del donatore
Prima di T specifici o cellule B possono essere utilizzati come cellule del donatore di generare modelli di topo transnuclear, topi devono essere infettato da un agente patogeno di interesse o immunizzati con un antigene di interesse. Dal momento che abbiamo usato cellule CD8 + specifiche per Toxoplasma gondii, il seguente protocollo descrive la generazione e l'isolamento di queste cellule e deve essere adattata in base agli interessi personali.
- Cisti derivata da un omogenato cervello di topo (circa 40) sono iniettati intra-peritoneally in BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) topi, che consente l'isolamento di entrambe le H-2 b e H-2 d limitato cellule T CD8 +.
- Al culmine della risposta immunitaria, il topo infetto è eutanasia, la milza isolati e messi in un piatto contenente 6 ml di globuli rossi (RBC) tampone di lisi.
- Utilizzando i lati smerigliato di due scivoli di copertura, la milza è attentamente terra e incubato nel buffer di lisi per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 14 ml di PBS, filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta da 50 ml falco e centrifugare per 5 min a 300 gr.
- Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di PBS e trasferire in una provetta 1,5 ml Eppendorf. Centrifugare per 5 minuti a 300g e rimuovere il surnatante dopo.
- Risospendere il pellet cellulare in 50 microlitri di PBS, aggiungere gli anticorpi fluorescente per identificare il tipo di cellula di interesse (ad es CD3, B220, CD8 e CD4), e fluorescente MHC-I tetramero (MHC-II tetramero di cellule T CD4) caricato con il peptide di interesse alla sospensione cellulare e incubare per 30 minuti a 4 ° C.
- Aggiungere 1 ml di PBS, centrifugare per 5 min a 300 g, risospendere pellet in 3 ml di PBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta.
- Eseguire FACSorting impostando le porte rigorosamente (Figura 1B).
2. Cellule somatiche
Ci sono un paio di protocolli per il trasferimento nucleare di cellule somatiche. Quella descritta qui fa uso di ovociti arrestate in metafase-II e l'inibizione della seconda divisione meiotica con citocalasina B. Pertanto le cellule del donatore sono necessari che sono in fase G0/G1.
- Preparazione degli ovociti
- Topi di sesso femminile di BDF1 sfondo vengono iniettati all'interno peritoneally con 5IU PMS per il mouse 05:00-7:00.
- Circa 47 ore più tardi, ogni mouse viene iniettato all'interno peritoneally con HCG 5IU.
- Preparare un piatto di cultura (KSOM-AA scende sotto olio) per gli ovociti, il giorno stesso l'iniezione di HCG e metterli in un incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. Inoltre, preparare gli aghi necessari per SCNT (7μm per l'enucleazione e 4 o 5 micron per il trasferimento nucleare di nuclei di linfociti), caricandoli con il mercurio.
- Euthanize topi e isolare ovidotti circa 13h dopo HCG (circa 8:00). Raccogliere gli ovidotti in 1-2 gocce di HCZB.
- Uno per uno spostare il ovidotti in una goccia contenente M2 w / ialuronidasi. Nick the ovidotto accuratamente con un pinza e spostare l'ovocita-cumulo-complesso in calo. Dopo tutto ovocita-cumulo-complessi sono stati isolati, il piatto viene incubata a 37 ° C.
- Dopo 2-5 minuti (il tempo esatto dipende dal lotto di ialuronidasi) raccogliere gli ovociti, lavare in HCZB e la piastra li in KSOM-AA gocce.
- Enucleazione degli ovociti
- Utilizzare il coperchio di una capsula di Petri per preparare il piatto SCNT. Impostare il microscopio e il micromanipolatore.
- Lavare l'ago enucleazione (7 micron) in PVP prima di iniziare con l'enucleazione.
- Per enucleazione, posto un gruppo di ovociti (10-30) in una goccia di HZCB con citocalasina B (5 mg / mL). Durante l'incubazione (min. 5 min) line-up degli ovociti orizzontalmente.
- Prendete un ovocita e posto di fronte a l'ago in mano. Fissare l'ovocita per l'ago tenendo mediante l'applicazione di un vuoto. Utilizzando l'ago enucleazione, girare l'ovocita fino a quando il cromosoma-fuso-complessi (CSC, spesso chiamato il "nucleo") è in posizione ore 3.
- Utilizzando piezo-pulse penetrare la zona pellucida con attenzione senza danneggiare l'ovocita. Luogo l'apertura dell'ago adiacente alla metafase II mandrino e applicare il vuoto. Il "nucleo" dovrebbe lentamente entrare nella ago, e la membrana dovrebbe sigillare una volta che è completamente rimosso.
- Trasferire il ovociti enucleati indietro nel KSOM-AA gocce, e lavarli più volte. Ripetere l'indirizzo enucleazione passi con un nuovo gruppo di ovociti. Continuare fino a quando tutte le uova sono enucleato o fino a circa 11:00.
- Trasferimento nucleare
- Per il trasferimento nucleare, cambio l'ago enucleazione (7 micron) con un ago di trasferimento nucleare (4 o 5 micron) e lavarlo con PVP.
- Luogo le cellule di interesse (ad esempio cellule T CD8 +) in una caduta con PVP, mescolare bene e incubare per un minimo di 10 min.
- Posizionare un gruppo di ovociti enucleato (10-30) in una goccia di HCZB con citocalasina B (2,5 mg / ml). Durante l'incubazione (min. 5 min) line-up degli ovociti in posizione orizzontale utilizzando l'ago di trasferimento nucleare.
- Prendete una cellula donatrice dal PVP-cell sospensione e aspirare in-e-out fino a quando la membrana esterna ha abbattuto (frammenti della membrana e citoplasma dovrebbe essere visibile). Se necessario, un piezo-impulso può essere applicata. Una volta che un nucleo è stato isolato, sposta un po 'fino a l'ago, e continuano a raccogliere i nuclei fino ad avere 10-30.
- Sposta la goccia contenente gli ovociti enucleati allineati. Fissare un ovocita per l'ago tenendo applicando vuoto. Posizionare l'ago trasferimento nucleare (i nuclei dovrebbe essere lontano dalla apertura) adiacente alla zona pellucida e applicare piezo impulsi fino a quando l'ago è passato attraverso la zona pellucida. Muovere con cautela un nucleo alla punta dell'ago, spingere l'ago nel citoplasma dell'ovocita fino a quando la punta dell'ago è 2 / 3 all'interno. Applicare una piccola pressione negativa, in modo che un po 'della membrana dell'ovocita è l'ago.
- Il passo successivo è molto critica, poiché è l'unica volta in cui l'ovocita è in realtà "aperta". Applicare un singolo impulso di piezo, spingere il nucleo fuori l'ago, applicando una pressione positiva, con attenzione tirare indietro l'ago in modo che la punta è circa 1 / 3 nell'ovocita, e quindi applicare una pressione negativa e continuare a tirare indietro l'ago sigillare l'ovocita. Ripetere questo passaggio con ogni ovocita.
- Dopo tutti gli ovociti di un gruppo hanno ricevuto un nucleo, vengono lavate e coltivate in KSOM-AA media. Ripetete questa procedura con tutti gli ovociti.
- Dopo l'ultimo gruppo è stata culture in KSOM-AA per un minimo di 30 minuti, il SCNT-embrioni vengono trasferiti in gocce di Ca-multimediale gratuito attivazione contenente SrCl2.
- Dopo 6 ore di attivazione, la quantità di pseudo-pronuclei (PPN)-positivi SCNT-embrioni è determinata. Gli embrioni vengono poi lavate e coltivate in KSOM-AA gocce per altri 3,5 giorni fino a quando hanno raggiunto lo stadio di blastocisti.
- Farmaci o sostanze chimiche di scelta (come la tricostatina A) può essere aggiunto alla attivazione e terreni di coltura.
3.Derivation delle cellule staminali embrionali
Il SCNT-blastocisti può essere utilizzato sia per trasferirli in pseudo-femmine gravide (noto anche come clonazione diretta o one-step) o per ottenere cellule staminali embrionali (noto anche come clonazione indiretti o due fasi). Dal momento che è molto più efficiente per generare cellule staminali embrionali, scegliamo la procedura in due fasi. Nel caso in cui lo scienziato è interessato nella clonazione diretta, la blastocisti possono essere trasferiti direttamente in pseudo-femmine gravide, come descritto nella sezione 5.
Ci sono molti protocolli descrivono la derivazione di cellule staminali embrionali. Quello qui descritto è una tecnica standard, che utilizza le cellule di alimentazione, e siero fetale di vitello.
- Il secondo giorno dopo il trasferimento nucleare, preparare un piatto 96-U-e per la derivazione delle cellule ES.
- Aggiungere 100 ul gelatina in ciascun pozzetto di una piastra 96-U-bene, incubare per un minimo di 10 minuti, e rimuoverlo in seguito.
- Cellule alimentatore disgelo e risospendere in un volume a seconda del mezzo ESD, ad esempio, le cellule di alimentazione pari a una superficie di 25 cm 2 sono risospesi in 10 ml di mezzo di scariche elettrostatiche e 200 ml di sospensione cellulare viene aggiunto in ciascuno dei gelatina-trattati bene.
- Mettere la piastra in un incubatore e la cultura a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Dopo 3,5 giorni, gli embrioni dovrebbero essere allo stadio di blastocisti.
- Preparare un piatto sterile batterica da placcatura poche gocce di medie ES cellulare e thyrode acido.
- La blastocisti sono prima trasferite dal KSOM-AA scende in gocce contenenti normale media delle cellule ES e lavato due volte.
- Cura il trasferimento di un gruppo di blastocisti (blastocisti 5-10) in una goccia di thyrode acide e tenere lì fino alla zona pellucida si è dissolto.
- Le blastocisti sono poi trasferiti in una goccia di media ES, lavato due volte, e poi messo nell'alimentatore rivestite 96-U-pozzetti (una blastocisti in un pozzo).
- Gli embrioni vengono poi coltivate per 5-7 giorni in incubatrice a 37 ° C, 5% di CO 2 senza disturbarli. Questo dà il tempo ad un embrionettach allo strato alimentatore, e di formare una conseguenza.
- Preparare 24 pozzetti, con circuiti elettrici placcatura in media ESD in ciascun pozzetto, ad esempio, risospendere un equivalente di 50 cm 2 alimentatore in 12 ml di mezzo di scariche elettrostatiche, e aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto.
- Rimuovere con attenzione il supporto ESD dalla piastra 96-U-bene con gli embrioni, lavare ogni pozzetto due volte con 250 microlitri Hepes (o PBS), aggiungere 50 microlitri tripsina e incubare per circa 5 minuti a 37 ° C.
- Pipetta su e giù più volte, fino a quando escrescenza si è sfasciata in una cella singola sospensione, trasferimento in un 24-pozzetti ed incubare a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Se la derivazione ESC ha avuto successo, colonie CES dovrebbe essere visibile dopo 7-10 giorni.
4.Blastocyst iniezione
L'iniezione di blastocisti è una tecnica di routine per generare qualsiasi tipo di modello di topo transgenico. E 'importante ricordare che l'iniezione di blastocisti e il successivo trasferimento in pseudo-donne incinta ha bisogno di essere cronometrati bene.
- Primo topi femmina con PMS e HCG, come descritto nella sezione 2.1. Dopo l'iniezione di HCG mettere topi femmina insieme a topi maschi (una femmina ed un topo maschio per gabbia).
- Il giorno seguente, controllare le femmine per spine. Questo viene conteggiato come 0.5dpc (giorni post coito).
- Embrioni fecondati vengono poi isolate dal ovidotto, come descritto nella sezione 2.1, e colto in KSOM-AA per ulteriori 3 giorni.
- Preparare le cellule ES, al momento della iniezione blastocisti (3.5dpc).
- Rimuovere medio a partire da cellule ES, lavare due volte con Hepes (o PBS), aggiungere tripsina e incubare per 5 minuti a 37 ° C.
- Risospendere le cellule trypsinized con media ES, piatto in un piatto, e incubare per 45-60 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 per ridurre la quantità di cellule di alimentazione (alimentatore cellule aderiscono più velocemente rispetto alle cellule ES).
- Trasferire la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta e centrifugare per 5 min a 1000rpm.
- Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di media ES e memorizzare su ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Preparare il coperchio di un piatto sterile batterica da gocce placcatura contenente PVP e HCZB.
- Preparare un 15 ago micron caricando con il mercurio, collocandolo in posizione e il lavaggio con PVP.
- Posizionare un gruppo di blastocisti (10-30 blastocisti) in una goccia con HCZB, e aggiungere 5-50 microlitri della sospensione di cellule ES (dipende dalla concentrazione) in un'altra goccia di HCZB.
- Raccogliere le cellule ES (50-100 cellule) con l'ago di iniezione.
- Sposta la goccia con le blastocisti. Allineare la blastocisti in orizzontale, e fissare una con l'ago tenendo applicando vuoto.
- Utilizzando l'ago di iniezione girare la blastocisti fino a quando la massa cellulare interna (ICM) è nella posizione ore 9.
- Posizionare l'ago di iniezione a ore 3, assicurarsi che non ci sono cellule staminali sulla punta dell'ago, e applicare piezo-impulso che l'ago dell'iniezione penetra attraverso la zona pellucida e la trophectoderm nel blastocele.
- Rilasciare un paio di cellule ES (5-15 cellule), in modo che le cellule ES bastone per l'ICM. Continuare fino a quando tutti blastocisti di un gruppo sono state iniettate cellule ES.
- Dopo un gruppo di blastocisti è finito, lavarli due volte in KSOM-AA e tenerli in una goccia con KSOM-AA fino a quando tutti blastocisti vengono iniettati.
5. Embryo Transfer
Il trasferimento di embrioni in pseudo-femmine gravide rappresenta una procedura chirurgica, che deve essere effettuata con molta attenzione e secondo le linee guida di istituto del ricercatore.
- Anestetizzare topi riceventi femminile, la barba quadrante inferiore destro, e da disinfettare.
- Utilizzando le forbici aperte sulla pelle, e separare il peritoneo dalla pelle.
- Individuare l'ovaio attraverso il peritoneo (macchia rossa), e aprire il peritoneo in prossimità dell'ovaio.
- Utilizzando una pinza, con attenzione afferrare il ovidotto e tirare fuori l'utero.
- Prendete un gruppo di circa 10 blastocisti con un capillare collegato ad una pipetta a bocca.
- Fissare l'utero con una pinza, pugno nel suo complesso in piccolo con un piccolo ago, e inserire il capillare con le blastocisti nel lume dell'utero.
- Con attenzione rilascio degli embrioni in utero, e rimuovere il capillare.
- Spingere l'utero indietro nella cavità addominale.
- Individuare i margini del peritoneo e chiudere con un paio di punti.
- Chiudere la pelle del mouse con un paio di graffette.
- Per dolore post-operatorio, somministrare 5 mg Carprofen per mg di peso corporeo.
Figura 1. Nucleare di cellule somatichetrasferimento di pre-definite cellule T in B6CF1 sfondo. Numeri assoluti e relativi di embrioni generati da cellule CD8 + T e le cellule staminali embrionali derivate da blastocisti SCNT.
Figura 2. Analisi del flusso rappresentante citometria di topi chimerici con SCNT iniettato cellule staminali embrionali. Cancello e numero (cento per totali cellule T CD8 +) indica la presenza di specifiche cellule CD8 + T nei topi chimerici.
Discussion
Abbiamo dimostrato qui che SCNT può essere utilizzato per generare topi transnuclear dalle cellule T con pre-definiti specificità. Anche se non qui, la tecnica dovrebbe anche essere utilizzabile per generare topi transnuclear da cellule B pre-definita specificità.
Una cosa importante da considerare è il ceppo e il sesso di topo, che è stato infettato o immunizzate e per isolare le cellule T o B di interesse. Dato che le cellule T e B hanno un rendimento molto basso riprogrammazione in generale, si consiglia di utilizzare ibridi F1 di aplotipo desiderato. Poiché la cellula donatrice determina anche il sesso, si consiglia di utilizzare T o linfociti B di topi maschi. Questo significa che solo i topi maschi chimerici trasmetterebbe le BCR o TCR attraverso la linea germinale, con i topi maschi è stato più facile e veloce per riprodursi.
Nel loro insieme, pensiamo che riprogrammazione epigenetica tramite SCNT rappresenta un potente strumento per generare un nuovo tipo di modelli di mouse, che sarà di grande vantaggio per il campo immunologico.
Disclosures
Un brevetto è stato depositato.
Acknowledgments
Gli autori sono grati a H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, e G. Yap per proficue discussioni e reagenti. Siamo grati a J. Dausman, R. Flannery, e J. Jackson per l'assistenza con la gestione della colonia del mouse. Siamo grati a P. Wisniewski per FACSorting. EMF è stato sostenuto dal Programma di Scienze Umane Frontiere. RJ è stato sostenuto dal National Institute of concede Salute RO1-HD045022 e R37-CA084198. HLP è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Blood Cell lysis Buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | REF 352340 | |
| Pregnant Mare Serum (PMS) | Calbiochem | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Calbiochem | 230734 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | Type IV-S |
| KSOM-AA | EMD Millipore | MR-106-D | |
| HCZB | EMD Millipore | MR-173-D | Customized medium |
| Ca-free medium for activation | EMD Millipore | MR-174-D | Customized medium |
| SrCl2 | Sigma-Aldrich | 255521 | 100mM = 10x |
| AlbuMAX I | GIBCO, by Life Technologies | 11020-021 | |
| PVP | MP Biomedicals | 102787 | Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | 500μg/ml = 100x |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | 5mM = 1000x |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| Holding needle | Humagen | MPH-SM-30 | |
| Injection and transfer needles | Humagen | 4-15, 7-15, 15-15 | |
| Mouth pipette | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | or something similar |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | or something similar |
| Wound Clip Applicator | BD Biosciences | 427630 | |
| Wound Clips | BD Biosciences | 427630 | |
| Suture | Ethicon Inc. | K871H | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 15% |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100x |
| Glutamin | MP Biomedicals | 101806 | 200mM = 100x |
| Non-essential Aminoacids | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | 100x |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985-023 | 5μl in 500ml |
| LIF | EMD Millipore | ESG1106 | 1000x |
| MEK inhibitor | Cell Signaling Technology | 9900L | For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50μM) |
References
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