Summary
Это видео показывает, как вызвать аутоиммунные гипофизит в SJL мышей и как оценить ее тяжесть по гистопатологии.
Abstract
Аутоиммунные гипофизит могут быть воспроизведены экспериментально инъекции гипофиза белки смешать с адъювантной в чувствительные мышей 1. Мышь модели позволяют исследовать как болезни разворачиваться, часто обеспечивая хорошее реплику одного и того же процессы, происходящие в организме человека. Для некоторых аутоиммунных заболеваний, как диабет типа 1А, Есть модели (NOD мыши), которые спонтанно развиваться болезнь похожа на человека коллегой. Для многих других аутоиммунных заболеваний, однако, модель должна быть вызвана экспериментально. Общий подход в этом отношении является для введения мышь с доминирующей антигена происходит от органов изучается. Например, исследователи заинтересованы в аутоиммунный тиреоидит вводят мышам с тиреоглобулина 2, и тех, кто интересуется миастения вводить их с рецептором ацетилхолина 3. Если аутоантиген для конкретного аутоиммунного заболевания неизвестна, исследователи вводят неочищенный экстракт белка из органов мишенью аутоиммунной реакции. Для аутоиммунной гипофизит, патогенных аутоантиген (ы) еще предстоит идентифицировать 4, и, таким образом сырой гипофиза подготовки белок используется. В этом видео статье мы покажем, как вызвать экспериментальный аутоиммунный гипофизит в SJL мышей.
Protocol
Экспериментальный протокол
После гипофиза иммуногена готова (см. сопутствующую статью), он вводится подкожно в SJL мышей (Jackson Laboratories, акции 000 686). Второй идентичный инъекции повторяют через 7 дней. Мыши которые затем используются для сбора в естественных условиях и посмертные результаты.
Шаг 1. Подкожные инъекции гипофиза иммуногена в SJL мышей
Мыши первой анестезией путем введения 0,5 мл 20 мг / мл 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin, TCI Америки, Т-1420) внутрибрюшинно. Мыши затем вводили подкожно по 100 мкл эмульсии гипофизом, что, как указано в спутник Юпитера 2181 статьи, содержит 1 мг экстракта гипофиза и 0,25 мг полного адъюванта Фрейнда. Эмульсии вводят в левый спинной задних регионе ноги ((50 мкл) и правой паховой области (50 мкл). Гипофиза эмульсии вводят снова на 7 день в противоположную сайтов (50 мкл в правой спинной задние ноги и область 50 мкл в левой паховой области). Мыши контролируется на ежедневной основе в течение первых 3 дней, а затем раз в неделю до дня жертвы, которые, как правило, через 28 дней после первой иммунизации.
Шаг 2. Сборник в естественных результатах: Blood тесты
Ткани наиболее часто используется для оценки результатов экспериментальных мышей в то время как все еще живы в крови. Кровь обычно обращается через 14 дней после первой иммунизации для измерения сывороточных уровней гипофиза антител или других маркеров, как цитокинов и хемокинов.
Кровь собирается из живых мышей в следующем. Мыши проходят надежно шиворот и задней части челюсти находится. Как только заднюю часть челюсти находится, 4 ланцеты мм используются для прокалывания подчелюстной сосудистого пучка. После кровь собирается, давление на на области с помощью алкоголя тампон, чтобы избежать гематомы. Сборник крови центрифугируют при 2000 г в течение 20 минут, и хранится при температуре -80 ° С до использования.
Шаг 3. Сборник посмертные результаты: гипофиз гистопатология
Мыши, как правило, пожертвовал 28 дней после первой иммунизации. Кардинальной функции необходимо установить диагноз EAH является проникновение гипофиз от гемопоэтических моноцитов.
Мыши эвтаназии, помещая их в герметичную камеру пластика, который озарен CO 2. Мыши держат в камере в общей сложности на 8 минут. После эвтаназии, гипофиз собираются, как описано в статье компаньона. Больные гипофиза появляется опухшие и более прочно приверженцем окружающей мозговой оболочки. Sharp щипцов используются, чтобы ослабить мозговых оболочек окружающих гипофиза. После гипофиза свободно перемещается на клиновидной кости, один конец гипофиз схватил пинцетом и гипофиза тщательно сняты. Железы помещают в пробирку, содержащую микроцентрифужных фиксатором 5 Beckstead в. Гипофиз фиксируется на ночь, завернутый в объектив бумаги, и помещают в кассету. Желез затем обрабатываются с помощью следующих протоколов:
| Номер станции | Реагент | Время в минутах | Температура (по Цельсию) |
| 1 | 70% алкоголя | 5 | 25 |
| 2 | 70% алкоголя | 15 | 25 |
| 3 | 95% алкоголя | 15 | 25 |
| 4 | 95% алкоголя | 15 | 25 |
| 5 | 100% спирта | 15 | 25 |
| 6 | 100% спирта | 7,5 | 25 |
| 7 | 100% спирта | 7,5 | 25 |
| 8 | ксилол | 20 | 25 |
| 9 | ксилол | 20 | 25 |
| 10 | ксилол | 25 | |
| 11 | парафин | 30 | 58 |
| 12 | парафин | 5 | 58 |
| 13 | парафин | 5 | 58 |
После обработки, гипофиза железы в парафин и не менее 5 непоследовательных разделы (5 мкм) вырезаны из каждой железы. После секционирования, железы, окрашенных гематоксилином и эозином и анализировали количественно мононуклеарных инфильтрации. Раздел с наиболее тяжелой инфильтрации выбран для скоринга. Тяжести оценивается на основе субъективной оценки степени передней доли гипофиза замены или разрушения иммунных клеток: степень 0, никакой болезни, категория 1, 2% -20% участия; 2-й степени, 20% -30%, 3-й степени, 30% -50%, 4-й степени, 50% -90%, 5-го класса, больше 90%. Все разделы забил два человека знали о источник разделов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Четыре методы были зарегистрированы, чтобы побудить гипофизит у экспериментальных животных. Методике, описанной в этой статье, то есть введение гипофиза белки смешать с адъювантом Фрейнда с, является старейшим, начиная с 1967 года 6, и был улучшен в последнее время 1. Другие методы инъекции растворимого гликопротеинов вируса краснухи в 1992 году 7, стереотаксической инъекции аденовируса прямо в гипофиз, в 2002 году 8, и трансплантация гипофиза с одной крысы деформации при почечную капсулу другого крыса напряжение в 2010 9 . Главное преимущество адъювантной подход Фройнд с том, что она является менее инвазивной, более последовательной и, прежде всего, более точно в стимулировании болезнь, которая очень напоминает человеческий аналог. Методике, описанной в этом видео статьи дает воспроизводимые модели гипофизит, которые могут быть использованы следователями, чтобы улучшить наше понимание этой увлекательной болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант DK080351 к ПК, а щедрый подарок от Терри и Кристин Гор семьи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K.
