Summary
När en gen har identifierats som potentiellt eldfasta för malaria, måste det utvärderas för sin roll i att förebygga Plasmodium infektioner inom mygga. Detta protokoll visar hur omfattningen av Plasmodium infektioner av myggor kan analyseras. De tekniker för att förbereda gametocyte kultur, membran utfodring myggor blod, och testmetoder för virus titer i myggans midgut demonstreras.
Abstract
När en gen har identifierats som potentiellt eldfasta för malaria, måste det utvärderas för sin roll i att förebygga Plasmodium infektioner inom mygga. Detta protokoll visar hur omfattningen av Plasmodium infektioner av myggor kan analyseras. De tekniker för att förbereda gametocyte kultur, membran utfodring myggor blod, och testmetoder för virus titer i myggans midgut demonstreras.
Protocol
A. Beredning av gametocyte kultur:
- Ta med färskt blod och serum till 37 ° C i vattenbad.
- I ett dragskåp under sterila förhållanden, Pipettera 1 ml varmt blod till ett Eppendorf-rör. Snurra blodet i en centrifug i 5 minuter vid 2200 rpm. Erytrocyter bör pelleterat, ta bort och kassera den klara serum. Tvätta erythocytes med en lika stor volym av nya serum 3 gånger för att få helblod för gametocyter.
- Hämta den gametocyte kulturen från CO 2 inkubator eller ljus burk. Denna kultur bör bibehållas på RPMI media och matas till myggen på dag 16 av kulturen. För att bestämma gametocytemia% (dag 16 av kulturen) gör en tunn smet på en glasplatta med en droppe blod och utföra en Geimsa fläck. Bestäm antalet könsceller i ett fält av parasiten kulturen. Det är oftast i intervallet 2 - 4%. Beräkna volymen av blod som du behöver för att uppnå den önskade slutliga% gametocytemia (0,3 -1%).
- Ta bort de flesta medier från gametocyte kultur med hjälp av en pipett, se till att inte störa eller suga upp de parasiter (parasiter kommer att visas som svart medan media kommer vara lätt rosa / röd). Pipettera resten av media och parasiter i en 15 ml Falcon rör. Snurra i en centrifug i 5 minuter vid 2200 rpm. Parasiter och erytrocyter kommer pellets, ta bort och kasta media supernatanten utan att störa parasiter.
- Kombinera parasiter med volymen beredd helblod (från steg A2) att ge dig den önskade slutliga gametocytemia enligt tidigare beräkningar. Pipettera att blanda väl. (~ 1 minut)
Detta är nu provet kommer du att mata dina myggor. Förvara vid 37 ° C i ett vattenbad.
B. Utfodring myggor:
- Sätt din Anopheles myggor (~ 30-50) i vax-fodrade kartong koppar täckta med mesh nät säkras genom ett gummiband eller kartong lock levereras med kopp. Vi använder en batteridriven aspirator för detta steg.
- Förbered cirkulationen vattenbad genom att sätta in munstycken på båda sidor av glas matare till gummislang. Anslut så många matare som du behöver i en serie, den ena änden av serien ska anslutas med slang till cirkulationspumpen i vattenbad (den del som pressar vatten genom matare), bör den andra änden av serien består av gummislang nedsänkt i badet så att cirkulerande vatten för att tömma tillbaka till badet. Slå på badet tills vattnet är ca 37 ° C och vattnet cirkulerar genom matare och tillbaka till badet. Detta är viktigt att hålla blodet varmt och hålla parasiter vid liv.
- Förbered membranet (vi använder små rutor sträckta parafilm) genom att sträcka runt glaset membranet mataren, med tryck sluter tätt till mataren öppningen. Detta membran kommer att imitera huden.
- Placera en feeder membran och ner på varje mygga kopp och säker matare med klämmor eller tejp. Membranet ska sitta jäms med nätet så myggor kan komma åt den från insidan av koppen.
- Noggrant pipett parasit-blodmjöl (från steg A5) i halsen på mataren, och se till att blodet går hela vägen genom halsen i reservoaren, kontakta membranet så att myggor kan komma åt blodet. Vi använder ca 200 l blod per feeder, men detta kan variera.
- Låt myggor till foder. Vi tillåter dem att foder till ≈ 30 minuter (varierar beroende på theexperiment, för de flesta experiment, ibland övervaka hur många redan tagit en måltid genom att titta på blodet innehåll i buken.)
- Efter utfodring, ta bort matare från mygga koppar. Stäng av vattenbad och koppla matare från slang.
- Ta bort membran och njuta matare i 10% blekmedel att sanera och skölj med vatten. Placera förorenade material (membran, pappershanddukar, handskar, etc.) i en liten biohazard väska och sätta in i ett stort biologiskt kärl.
- Bedöva myggor genom att placera koppar i kylskåp eller kylrum. När myggen är helt bedövad, överföra dem på en petriskål inbäddad i en ishink. Sortera myggor, titta noga på bakkroppen för några tecken på en blodmjöl, och kasta de som inte foder. Några myggor kommer att vara helt svullna, medan andra kommer att visa ett smalt band av intagen blod, alla är acceptabelt som "matas". Sätt matas myggorna tillbaka in i kartong koppar.
- Ge ett socker måltid (en bit bomull indränkt i 10% sackaros) till myggor, och inkubera under normala insectary förhållanden i 7 dagar. Varje dag bör myggor följas för dödligheten. Dessutom bör bomullen göras våt med sackaros, så att de inte berövas mat. Det är bättre, men ändå vill lägga till en pappershandduk fuktad med destillerat vatten för att hålla myggorna fuktig. Dessa myggor är s. falcipraum smittade, så alla försiktighet måste vidtas så att inga myggor kan ESCAPE från koppen. Det är bäst att sätta kopparna i en liten cagefor dubbelt skydd.
C. Analysera mygga midguts och uppskatta oocyst laster:
- Aspirera myggor (från steg B) från kartong koppar med hjälp av en batteridriven aspirator. Bedöva myggor, som är inuti avtagbara dammsugaren reservoar, genom att flytta till ett kallt rum eller begrava reservoaren i is i minst 5 minuter eller tills myggor slutar röra sig.
- Överföring sövda myggor från reservoaren till ett glas petriskål inbäddad i is. Sprid myggor till ett enda lager och täck med plast petriskål lock. Myggor som inte kan tillgodoses på skålen kvar i behållaren, som är tillbaka till kylrum eller is.
- Använda spetsig pincett, överföra en enda mygga från skålen till 100 ul PBS finns på en glasskiva monterad under en dissektion mikroskop. Lämna de andra täcks av kylda petriskål.
- Använda spetsig pincett, hålla myggor på bröstkorgen och den bakre buken. Dra kroppen isär tills midgut utsätts för. Använd pincett för att avlägsna överskott av vävnad från gut.The tarmen ser ut som en vit, sac-liknande kropp. Ta bort överflödigt vävnad från gut.Mount tarmen i en brunn på en 12-väl glasplatta och fördjupa sig i 5-10 l på 0,2% mercurochrome. Squash kroppen och kasta på fuktigt papper towel.Continue för andra myggor tills 12-bra bild är full. Täck monterad tarmar med ett glas täckglas.
- Undersök tarmar under ett ljusmikroskop, letar efter runda oocystor som färgas ljust rosa mot klart / svag rosa gut vävnad. Räkna oocystor, spela in och fortsätta till nästa prov. Fortsätt för alla myggor från alla experimentella behandlingar.
- När du är klar, torka bild rent med en pappershandduk. Placera en pappershandduk med tarmar, och pappershandduk med kadaver, i små biohazard påsen och kasta i papperskorgen. Handskar bärs under hela proceduren. Man ser till att inte låta någon infekterade myggor fly.
Discussion
Det kan finnas vissa variationer i Plasmodium smitta och infektion fenotyp beslutsamhet och olika laboratorier kan följa olika tekniker.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W.
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
