Summary
Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para a malária, deve ser avaliado pelo seu papel na prevenção de infecções Plasmodium dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão de infecções plasmodium de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas de preparação da cultura gametócitos, membrana alimentarem de sangue humano os mosquitos, e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.
Abstract
Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para a malária, deve ser avaliado pelo seu papel na prevenção de infecções Plasmodium dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão de infecções plasmodium de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas de preparação da cultura gametócitos, membrana alimentarem de sangue humano os mosquitos, e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.
Protocol
A. Preparação da cultura gametócitos:
- Trazem o sangue humano fresco e soro a 37 o C em banho-maria.
- Em uma capela, sob condições estéreis, pipeta de 1 mL de sangue quente em um tubo eppendorf. Girar o sangue em uma centrífuga por 5 minutos a 2200 rpm. Eritrócitos deve ser peletizada, remover e descartar o soro claro. Lavar eritrócitos com um volume igual de novo soro 3 vezes para obter o sangue total para a gametócitos.
- Recuperar a cultura gametócitos do CO 2 incubadora ou palmatória. Essa cultura deve ser mantida em RPMI mídia e alimentado para os mosquitos no dia 16 da cultura. Para determinar o gametocytemia% (no dia 16 de cultura) fazer um esfregaço fino sobre uma lâmina de vidro com uma gota de sangue e realizar uma Geimsa mancha. Determinar o número de gametas em um campo da cultura parasita. Geralmente é na faixa de 2-4%. Calcular o volume de sangue total que você vai precisar para alcançar o final desejado gametocytemia% (0,3 -1%).
- Remover a maioria dos meios de comunicação de sua cultura gametócitos usando uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar ou sugar os parasitas (parasitas aparecerá como preto, enquanto a mídia vai ser rosa claro / vermelho). Pipeta o resto da mídia e parasitas em um tubo falcon 15 ml. Girar em uma centrífuga por 5 minutos a 2200 rpm. Parasitas e eritrócitos vai pellet, remover e descartar media sobrenadante sem perturbar parasitas.
- Combine parasitas com o volume de sangue total preparadas (de A2 etapa) dar-lhe a gametocytemia final desejada de acordo com os cálculos anteriores. Pipeta para misturar bem. (~ 1 minuto)
Este é agora o exemplo que você vai alimentar a sua mosquitos. Manter a 37 º C em banho-maria.
Alimentação mosquitos B.:
- Ponha seu mosquitos Anopheles (~ 30-50) em copos de cera revestido de papelão coberto com malha de redes garantidos por uma faixa de borracha ou tampa de papelão fornecido com copo. Nós usamos um aspirador a pilhas para esta etapa.
- Prepare o banho-maria a circulação através da inserção de bicos em cada lado de alimentadores de vidro para tubos de borracha. Conectar como alimentadores quantas forem necessárias em uma série, um fim da série deve ser conectado por tubulação para o circulador do banho de água (a parte que empurra a água através do feeders), a outra extremidade da série deve ser composto de tubos de borracha submerso no banho para que a água distribuída aos vazios de volta para banho. Ligue o banho até que a água é de cerca de 37 º C ea água está a circular através do alimentadores e de volta para o banho. Isto é essencial para manter o aquecimento de sangue e manter os parasitas vivos.
- Prepare a membrana (usamos pequenos quadrados de parafilme esticado) esticando todo o alimentador de membrana de vidro, usando a pressão para selar firmemente a abertura do alimentador. Esta membrana vai imitar a pele.
- Coloque um alimentador da membrana voltada para baixo em cada copo mosquito e alimentadores seguro usando grampos ou fita adesiva. A membrana deve sentar-se alinhada com a rede para os mosquitos podem acessá-lo de dentro do copo.
- Cuidadosamente pipeta refeição parasita sangue (de A5 passo) para o pescoço do alimentador, certificando-se o sangue vai todo o caminho através do pescoço para dentro do reservatório, entrar em contato com a membrana de modo que o mosquito pode acessar o sangue. Usamos cerca de 200 mL de sangue por alimentador, mas isso pode variar.
- Permitir que mosquitos para se alimentar. Nós lhes permitem alimentar para ≈ 30 minutos (variável, dependendo theexperiment; para a maioria dos experimentos, ocasionalmente monitoramento quantos já tomaram uma refeição por olhar para o conteúdo sangüíneo no abdômen.)
- Após a alimentação, retire copos alimentadores do mosquito. Desligue o banho de água e desconecte alimentadores de tubos.
- Remover a membrana e mergulhe alimentadores em lixívia a 10% para descontaminar e enxágüe com água. Lugar material contaminado (membranas, toalhas de papel, luvas, etc) em um pequeno saco de risco biológico e depósito em um recipiente grande risco biológico.
- Anestesiar os mosquitos colocando copos na geladeira ou câmara fria. Uma vez que os mosquitos estão totalmente anestesiados, transferi-los em uma placa de Petri incorporado em um balde de gelo. Ordenar mosquitos, olhando atentamente para o abdômen para qualquer sinal de uma refeição de sangue, e descartar aqueles que não alimentam. Alguns mosquitos será totalmente ingurgitadas, enquanto outros mostram uma estreita faixa de sangue ingerido, todos são aceitáveis como "alimentados". Coloque os mosquitos alimentado de volta para os copos de papelão.
- Fornecer uma refeição de açúcar (um pedaço de algodão embebido em sacarose 10%) para os mosquitos, e incubar em condições normais de insetário durante 7 dias. Todos os dias, os mosquitos devem ser monitorados para a taxa de mortalidade. Além disso, o algodão deve ser molhado com a sacarose, para que eles não são privados de alimentos. É melhor, mas, para adicionar uma toalha de papel embebido em água destilada, para manter os mosquitos úmido. Esses mosquitos são P. falcipraum infectados, para que todos os cuidados devem ser tomados para que não os mosquitos podem ESCAPe do copo. É melhor colocar os copos em uma proteção cagefor pequena dupla.
C. Dissecting intestino médio do mosquito e estimar as cargas de oocistos:
- Aspirar mosquitos (da etapa B) de copos de papelão usando um aspirador a pilhas. Anestesiar os mosquitos, que estão dentro do reservatório aspirador removível, mudando-se para uma sala fria ou enterrar o reservatório no gelo por pelo menos 5 minutos ou até que os mosquitos parar de se mover.
- Transferência de mosquitos anestesiados do reservatório para uma placa de Petri de vidro embebidas em gelo. Espalhe os mosquitos em uma única camada e cubra com uma tampa de plástico placa de Petri. Mosquitos que não podem ser acomodados no prato permanecer no reservatório, que é retornado ao quarto frio ou gelo.
- Usando uma pinça de ponta fina, a transferência de um único mosquito do prato para 100 ul PBS contidos em uma lâmina de vidro montada em um microscópio de dissecação. Deixe os outros coberta na placa de Petri refrigeradas.
- Usando uma pinça de ponta fina, manter os mosquitos no tórax e do abdome posterior. Puxar o corpo para além até o intestino médio está exposto. Use uma pinça para remover o excesso de tecido do intestino gut.The se parece com um branco, saco-como corpo. Retire o excesso de tecido do intestino gut.Mount em um poço de uma lâmina de vidro de 12 bem e mergulhe em mL 10/05 de 0,2% mercurocromo. Squash a carcaça e descartar em towel.Continue papel úmido para outros mosquitos até o slide 12 bem-estar cheio. Cobrir a coragem montado com uma lamela de vidro.
- Examine coragem em microscópio de luz, à procura de oocistos redonda que mancha rosa brilhante contra o tecido do intestino clara / rosada. Contagem de oocistos, e continuar a gravar a próxima amostra. Continue para todos os mosquitos de todos os tratamentos experimentais.
- Quando terminar, limpe lâmina limpa com uma toalha de papel. Coloque a toalha de papel com coragem, e toalha de papel com carcaças, em saco de biohazard pequeno e descartar no lixo. As luvas são usadas durante todo o processo. Cuidado é tomado para não deixar escapar mosquitos infectados.
Discussion
Pode haver algumas variações na infecção de Plasmodium e determinação fenótipo infecção e laboratórios diferentes podem seguir diferentes técnicas.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
