Summary
Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.
Abstract
Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.
Protocol
A. gametocyte kültürünün hazırlanması:
- Taze insan kanı ve bir su banyosunda 37 o C serum getirin.
- Davlumbaz, steril koşullar altında, bir eppendorf tüpe 1 ml ılık kan pipetlemeyin. 2200 rpm'de 5 dakika santrifüj kan dönerler. Eritrositler pelet olmalıdır; açık serum çıkarın ve atın. Gametocytes için tüm kan elde etmek için yeni serum 3 kez eşit hacmi ile erythocytes yıkayın.
- CO 2 inkübatör veya mumluklar gametocyte kültürü al. Bu kültür, kültür 16 gün sivrisinek RPMI medya beslenen üzerinde muhafaza edilmelidir. Gametocytemia (% kültür 16 gün) belirlemek için bir damla kan ile bir cam slayt üzerinde ince bir yayma ve bir Geimsa leke gerçekleştirmek. Parazit kültürünün bir alanda gamet sayısını belirler. 2 aralığında genellikle% 4. Istenen final% gametocytemia (% 0.3 -1) hedeflere ulaşmak için gerekli bütün kan hacmini hesaplayın.
- , Bir pipetlemeyin kullanarak gametocyte kültür medya çoğu çıkarın özen rahatsız veya parazitler emmek (medya pembe / kırmızı ışık olacak parazitler siyah olarak görünecektir) değil. Medya ve parazitlerin 15 ml şahin tüpe geri kalanı pipetleyin. 2200 rpm'de 5 dakika santrifüj Spin. Parazitler ve eritrositler pelet, kaldırmak ve rahatsız edici parazitler olmadan supernatant medya atın.
- Önceki hesaplamalara göre istenilen son gametocytemia vermek için hazırlanmış tam kan hacmi (adım A2) ile parazitler birleştirin. Pipetleyin iyice karıştırın. (~ 1 dakika)
Bu sivrisinek yem örnek. Bir su banyosunda 37 ° C'de tutun.
B. Beslenme sivrisinek:
- Anofel sivrisinek (~ 30-50) bir lastik bant veya fincan ile birlikte karton kapak güvenli file örgü ile kaplı wax kaplı karton bardak içine koyun. Biz bu adımı için bir pil ile çalışan aspiratör kullanın.
- Kauçuk borular her iki tarafında cam besleyiciler memeleri ekleyerek sirkülasyon su banyosu hazırlayın. Bir dizi gibi çok sayıda besleyici olarak bağlayın; serisinin bir ucunu su banyosu (besleyiciler ile suyu iter parçası) sirkülatör boru ile bağlanmış olması gerekir, serinin diğer ucunu kauçuk boru oluşmalıdır dolaşan su banyosu içine boşaltmak için izin banyo batık. Su, yaklaşık 37 o C su banyosuna geri besleyiciler dolaşan ve kadar banyo açın . Bu kan sıcak tutmak ve parazitler canlı tutmak esastır.
- Membran (gergin parafilm küçük kareler), besleyici açılış için sıkı bir şekilde yapışması basıncı kullanarak, cam membran besleyici etrafında uzanan hazırlayın. Bu membran cilt taklit eder.
- Bir besleyici membran her sivrisinek fincan ve kelepçeler veya bant kullanarak güvenli besleyiciler üzerine yüzü aşağı yerleştirin. Sivrisinek fincan içinde erişebilmesi için membran net ile aynı hizada oturmak gerekir.
- Besleyici boyun dikkatle pipet parazit kan unu (adım A5), kan sivrisinekler kan erişebilmesi için membran başvurarak, rezervuar içine boyun aracılığıyla tüm yol gider emin olun. Biz yaklaşık 200 ul besleyici ortalama kan kullanabilirsiniz, ancak bu değişebilir.
- Sivrisinek beslemek için izin ver. Biz onlara ≈ 30 dakika boyunca beslemek için izin (theexperiment bağlı olarak, değişken; en deneyler için, bazen kaç zaten karın kan içeriğine bakarak yemek almış izleme.)
- Beslemeden sonra, sivrisinek bardak besleyiciler çıkarın. Su banyosu kapatın ve tüp besleyiciler kesmek.
- Membran çıkarın ve% 10 çamaşır suyu ve su ile durulayın dekontamine besleyiciler emmek. Büyük bir biohazard yuvasına küçük bir biyolojik tehlike çanta ve mevduat içine yerleştirin (membranlar, kağıt havlu, eldiven, vb.) Malzeme kirlenmiş.
- Buzdolabı veya soğuk oda bardak koyarak sivrisinek anestezisi. Bir kez sivrisinekler tamamen anestezi, bir buz kovasının içine gömülü bir petri aktarabilirsiniz. Sıralama sivrisinek, kan yemeğin herhangi bir işaret için karınlarına dikkatle incelemeniz ve yem etmedi bu atın. Bazı sivrisinek, diğerleri yutulur kan dar bir bant göstermek ise tamamen tıkanmış olacak "beslenen" olarak kabul edilir. Geri beslenen sivrisinekler karton bardak içine koyun.
- Sivrisinek bir şeker yemek (10% sakaroz batırılmış bir parça pamuk) sağlayın ve 7 gün boyunca, normal insectary şartlar altında inkübe edin. Her gün, sivrisinekler ölüm oranı açısından takip edilmelidir. Ayrıca, pamuk, gıda yoksun böylece, sakaroz ıslak olmalıdır. Bu sivrisinek nemli tutmak için, distile su ile ıslatılmış kağıt havlu eklemek için, henüz daha iyidir. Bu sivrisinek, P. falcipraum bulaşmış, tüm bakım sivrisinek yok ESCAP böylece alınmalıdıre fincan. , Küçük bir cagefor çifte koruma bardak koymak en iyisidir.
C. sivrisinek midguts Diseksiyon ve ookist yükleri tahmin:
- Pille çalışan bir aspiratörü kullanarak karton bardak aspire sivrisinek (adım B). Anestezisi sivrisinek, çıkarılabilir aspiratör rezervuar içinde, soğuk oda hareket ya da gömme rezervuar, en az 5 dakika veya sivrisinek durdurma hareketli kadar buz.
- Rezervuar buz gömülü bir cam petri anestezi sivrisinek aktarın. Sivrisineklerin tek bir katmana yayılmış ve, plastik bir petri kapak ile kapatın. Tabağına ağırlanamaz Sivrisinekler rezervuar, soğuk oda veya buz geri kalır.
- Ince uçlu forseps kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu altında monte edilmiş bir cam slayt üzerinde bulunan 100 ul PBS çanak tek bir sivrisinek aktarmak. Soğutulmuş petri kapsamındaki diğerleri bırakın.
- Ince uçlu forseps kullanarak, toraks ve posterior karın sivrisinek tutun. Midgut maruz kadar ayrı vücut çekin. Gut.The gut fazla doku çıkarmak için forseps kullanın, bir beyaz gibi, vücut kesesi gibi görünüyor. % 0.2 Merkürokrom 5-10 ul 12-iyi bir cam slayt ve batırmayın iyi bir gut.Mount gut fazla doku çıkarın. Squash diğer sivrisinekler için 12-iyi slayt kadar nemli kağıt towel.Continue karkas ve atın doludur. Bir cam lamel ile monte cesaret örtün.
- Işık mikroskobu altında soluk / açık pembe bağırsak dokusu karşı parlak pembe leke yuvarlak ookistleri arıyorsanız, cesaret inceleyin. Ookistleri Sayısı kayıt ve sonraki örnek devam edin. Tüm deneysel tedaviler tüm sivrisineklerin devam edin.
- Bittiğinde, slayt temiz bir kağıt havlu ile silin. Küçük biohazard torbaya, cesareti ile kağıt havlu ve karkaslar ile kağıt havlu koyun ve çöp kutusuna atın. Eldiven prosedür boyunca giyilir. Bakım enfekte sivrisinek kaçmasına izin alınır.
Discussion
Plasmodium enfeksiyon ve enfeksiyon fenotip belirlenmesi bazı farklılıklar olabilir ve farklı laboratuvarlar, değişik teknikler takip edebilirsiniz.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
