Summary
Una volta che un gene è identificato come potenzialmente refrattaria per la malaria, deve essere valutato per il suo ruolo nella prevenzione delle infezioni da Plasmodium all'interno della zanzara. Questo protocollo illustra come l'entità delle infezioni plasmodio di zanzare possono essere analizzati. Le tecniche per la preparazione della coltura gametocyte, nutrendosi di sangue umano membrana zanzare, e saggio titoli virale nel midgut zanzara sono dimostrati.
Abstract
Una volta che un gene è identificato come potenzialmente refrattaria per la malaria, deve essere valutato per il suo ruolo nella prevenzione delle infezioni da Plasmodium all'interno della zanzara. Questo protocollo illustra come l'entità delle infezioni plasmodio di zanzare possono essere analizzati. Le tecniche per la preparazione della coltura gametocyte, nutrendosi di sangue umano membrana zanzare, e saggio titoli virale nel midgut zanzara sono dimostrati.
Protocol
A. Preparazione della cultura gametocyte:
- Portare fresco sangue umano e nel siero a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- In una cappa aspirante, in condizioni sterili, pipettare 1 ml di sangue caldo in una provetta Eppendorf. Spin il sangue in una centrifuga per 5 minuti a 2200 giri al minuto. Eritrociti dovrebbero essere trasformati in pellet; rimuovere ed eliminare il siero chiaro. Lavare erythocytes con un uguale volume di nuovo siero 3 volte per ottenere il sangue intero per la gametociti.
- Recuperare la cultura gametocyte dal CO 2 incubatore o portacandele. Questa cultura deve essere mantenuta in RPMI media e alimentato le zanzare nel giorno 16 della cultura. Per determinare la gametocytemia% (il giorno 16 della cultura), preparare uno striscio sottile su un vetrino con una goccia di sangue e di eseguire una Geimsa macchia. Determinare il numero di gameti in un campo della cultura parassita. Di solito è nel range di 2 - 4%. Calcolare il volume di sangue intero che sarà necessario per ottenere il desiderato gametocytemia% finale (0,3 -1%).
- Rimuovere la maggior parte dei media dalla vostra cultura gametocyte utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non disturbare o aspirare i parassiti (parassiti apparirà come nero, mentre il supporto verrà rosa chiaro / rosso). Pipettare il resto dei media e parassiti in una provetta da 15 ml falco. Spin in una centrifuga per 5 minuti a 2200 giri al minuto. Parassiti e eritrociti si pellet, rimuovere e scartare i media sopranatante senza disturbare i parassiti.
- Combina i parassiti con il volume di preparato sangue intero (da A2 passo) per darvi la gametocytemia finale desiderato in base ai calcoli precedenti. Pipetta per mescolare completamente. (~ 1 minuto)
Questo è ora il campione si feed al tuo zanzare. Mantenere a 37 ° C in un bagnomaria.
B. Alimentazione zanzare:
- Metti il tuo zanzare Anopheles (~ 30-50) in cera alberato bicchieri di carta coperto con rete rete protetta da un elastico o coperchio di cartone forniti con tazza. Usiamo un a batteria Aspiratore per questo passo.
- Preparare la circolazione bagnomaria con l'inserimento di ugelli su entrambi i lati di alimentatori di vetro per tubi in gomma. Collegare come alimentatori di cui hai bisogno in una serie, una fine della serie devono essere collegati da tubi al circolatore del bagnomaria (la parte che spinge l'acqua attraverso gli alimentatori), l'altra estremità della serie dovrebbe essere costituito da tubi di gomma immersi nella vasca da bagno per permettere all'acqua circolare per svuotare di nuovo in bagno. Accendere il bagno fino a quando l'acqua è di circa 37 ° C e l'acqua circola attraverso gli alimentatori e di nuovo al bagno. Ciò è essenziale per mantenere il sangue caldo e mantenere i parassiti vivi.
- Preparare la membrana (usiamo piccoli quadrati di distese parafilm) con l'alimentatore che si estende intorno membrana di vetro, utilizzando la pressione per sigillare ermeticamente l'apertura di alimentazione. Questa membrana sarà imitare la pelle.
- Posizionare un alimentatore membrana rivolto verso il basso su ogni tazza di zanzara e alimentatori sicuro utilizzando fascette o nastro. La membrana deve sedersi a filo con la rete in modo zanzare può accedere dall'interno della coppa.
- Con attenzione pipetta parassita-farina di sangue (da A5 passo) nel collo dell'alimentatore, assicurandosi che il sangue va tutto il senso attraverso il collo nel serbatoio, contattando la membrana in modo le zanzare possono accedere al sangue. Utilizziamo circa 200 ml di sangue per alimentatore, ma questo può variare.
- Permettono di nutrire le zanzare. Permettiamo loro di mangimi per ≈ 30 minuti (variabile, a seconda theexperiment; per la maggior parte degli esperimenti, a volte monitoraggio quanti hanno già preso un pasto guardando il contenuto di sangue in addome).
- Dopo l'alimentazione, togliere alimentatori dalle coppe zanzara. Spegnere il bagno d'acqua e staccare alimentatori da tubo.
- Rimuovere la membrana alimentatori e immergersi nel 10% di candeggina per decontaminare e sciacquare con acqua. Luogo materiale contaminato (membrane, asciugamani di carta, guanti, ecc) in una piccola borsa rischio biologico e depositare in un recipiente di grandi dimensioni a rischio biologico.
- Anestetizzare le zanzare mettendo coppe in frigo o in camera fredda. Una volta che le zanzare sono completamente anestetizzati, trasferirli su una piastra di Petri incorporato in un secchiello del ghiaccio. Ordina zanzare, guardando attentamente l'addome per qualsiasi segno di un pasto di sangue, e scartare quelli che non sono stati caricati. Alcune zanzare sarà completamente gonfio mentre altri mostrano una stretta banda di sangue ingerito, tutti sono accettabili come "nutriti". Mettere le zanzare reimmessa nelle tazze di cartone.
- Fornire un pasto zucchero (un pezzo di cotone imbevuto di 10% saccarosio) alle zanzare, e incubare in normali condizioni insectary per 7 giorni. Ogni giorno, le zanzare devono essere monitorati per il tasso di mortalità. Inoltre, il cotone dovrebbe essere bagnato con il saccarosio, in modo che non siano privati di cibo. E 'meglio, ancora, per aggiungere un tovagliolo di carta imbevuto di acqua distillata, per mantenere le zanzare umido. Queste zanzare sono P. falcipraum infetti, in modo che tutti la cura deve essere presa in modo che le zanzare non possono ESCAPe dalla tazza. E 'meglio mettere le tazze in una protezione cagefor piccolo doppio.
C. Dissecting midguts zanzara e la stima dei carichi oocisti:
- Aspirare zanzare (dal passaggio B) da bicchieri di carta con un aspiratore a batteria. Anestetizzare le zanzare, che sono all'interno del serbatoio estraibile aspiratore, passando a una stanza fredda o seppellire il serbatoio in ghiaccio per almeno 5 minuti o fino a quando le zanzare si fermano.
- Trasferimento zanzare anestetizzati dal serbatoio di un piatto di vetro Petri incorporati nel ghiaccio. Diffondere le zanzare per un singolo strato e coprire con un coperchio di plastica capsula di Petri. Zanzare che non possono essere ospitati sul piatto rimangono nel serbatoio, che viene restituita alla camera fredda o ghiaccio.
- Utilizzando pinze a punta fine, il trasferimento di una zanzara dal piatto a 100 ul di PBS contenute su un vetrino montato sotto un microscopio dissezione. Lasciare gli altri coperti nel piatto freddo di Petri.
- Utilizzando pinze a punta fine, tenere le zanzare al torace e l'addome posteriore. Tirare il corpo senza fino a quando il midgut è esposto. Usare pinze per rimuovere il tessuto in eccesso dal budello gut.The appare come un bianco, sac-come corpo. Rimuovere il tessuto in eccesso dal gut.Mount l'intestino in un pozzetto di un 12-ben vetrino e immergere in 5-10 microlitri di 0.2% mercurocromo. Squash e gettare la carcassa in towel.Continue carta umida per altre zanzare fino al 12-scivolo bene è pieno. Coprire il coraggio montato con un coprioggetto di vetro.
- Esaminare fegato al microscopio ottico, alla ricerca di oocisti rotonda che macchia rosa brillante contro il chiaro / tenue tessuto intestinale rosa. Conte oocisti, registrare e continuare con il campione successivo. Proseguire per tutte le zanzare da tutti i trattamenti sperimentali.
- Al termine, asciugare vetrino pulito con un tovagliolo di carta. Posizionare il tovagliolo di carta con le budella, e tovagliolo di carta con le carcasse, in piccolo sacchetto e gettarlo nella spazzatura. I guanti sono indossati in tutto procedura. Si fa attenzione a non lasciare alcuna fuga le zanzare infette.
Discussion
Ci possono essere delle variazioni in Plasmodium l'infezione e il fenotipo determinazione infezione e laboratori diversi possono seguire diverse tecniche.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
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