Summary
Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.
Abstract
Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.
Protocol
A. Bereiding van gametocyt cultuur:
- Breng vers menselijk bloed en serum tot 37 o C in een waterbad.
- In een zuurkast, onder steriele omstandigheden, pipet 1 ml warm bloed in een eppendorfbuisje. Spin het bloed in een centrifuge gedurende 5 minuten bij 2200 rpm. Erytrocyten moet worden gepelletiseerd; te verwijderen en gooi de heldere serum. Was erythocytes met een gelijk volume van nieuwe serum drie keer om de volbloed voor de gametocyten te verkrijgen.
- Haal de gametocyt cultuur van de CO 2 incubator of kaars pot. Deze cultuur moet worden gehandhaafd op RPMI media en gevoed aan de muggen op dag 16 van de cultuur. Voor het bepalen van de gametocytemia% (op dag 16 van de cultuur) een dunne uitstrijkje op een glasplaatje met een druppel bloed en het uitvoeren van een Geimsa vlek. Bepaal het aantal van gameten in een veld van de parasiet cultuur. Het is meestal in het bereik van 2 - 4%. Bereken het volume van het bloed dat je nodig hebt om de gewenste uiteindelijke% gametocytemia (0,3 -1%) te bereiken.
- Verwijder het merendeel van de media van uw gametocyt cultuur met behulp van een pipet, en zorg niet te verstoren of tot zuigen de parasieten (parasieten verschijnt als zwart, terwijl de media zullen worden licht roze / rood). Pipetteer de rest van de media en parasieten in een 15 ml falcon buis. Spin in een centrifuge gedurende 5 minuten bij 2200 rpm. Parasieten en erytrocyten zullen pellet, te verwijderen en gooi media supernatans zonder storende parasieten.
- Combineer parasieten met het volume van de bereide volbloed (van stap A2) om u de gewenste uiteindelijke gametocytemia volgens eerdere berekeningen. Pipet om goed te mengen. (~ 1 minuut)
Dit is nu de sample die u zal voeden van uw muggen. Bewaren bij 37 ° C in een waterbad.
B. Feeding muggen:
- Zet uw Anopheles muggen (~ 30-50) in de wax-beklede kartonnen bekers bedekt met gaas gaas beveiligd door een rubberen band of kartonnen deksel geleverd met beker. We maken gebruik van een batterij-aangedreven aspirator voor deze stap.
- Bereid de circulatie water-bad door het invoegen van sproeiers aan beide kanten van glas feeders aan rubber slang. Sluit zo veel feeders als je nodig hebt in een serie, een einde van de serie moet worden aangesloten door slang aan op de circulatiepomp van het waterbad (het deel dat water duwt door de feeders), moet het andere uiteinde van de serie bestaat uit rubber slangen ondergedompeld in het bad, zodat het water verspreid om terug leeg in bad. Zet het bad totdat het water is ongeveer 37 o C en het water circuleert door de feeders en weer terug naar het bad. Dit is essentieel om het bloed warm te houden en de parasieten in leven te houden.
- Bereid de membraan (we gebruik van kleine vierkantjes uitgerekt Parafilm) door het uitrekken van rond de glazen membraan feeder, met behulp van druk om goed af, de feeder opening. Dit membraan wordt de huid na te bootsen.
- Plaats een feeder membraan naar beneden op elk mug cup en veilig feeders met behulp van klemmen of tape. Het membraan moet spoelen zitten met het net, zodat muggen kunnen er toegang vanuit de beker.
- Zorgvuldig pipet parasiet-bloed maaltijd (van stap A5) in de hals van de feeder, zorg ervoor dat het bloed gaat helemaal door de nek in het reservoir, contact opnemen met de membraan, zodat de muggen kunnen het bloed te openen. We maken gebruik van ongeveer 200 ul bloed per feeder, maar dit kan variëren.
- Laat muggen te voeden. We kunnen ze voer voor ≈ 30 minuten (variabel, afhankelijk van de theexperiment, voor de meeste experimenten, zo nu en dan controleren hoe velen hebben al een maaltijd innemen door te kijken naar het bloed-gehalte in de buik.)
- Na het voeden, verwijder feeders uit de mug bekers. Zet het waterbad en koppel feeders van de slang.
- Verwijder het membraan en genieten feeders in 10% bleekwater te ontsmetten en spoelen met water. Plaats verontreinigd materiaal (membranen, papieren handdoeken, handschoenen, etc) in een kleine biohazard tas en deponeren in een grote biohazard opvangbak.
- Verdoven muggen door het plaatsen van cups in koelkast of koude kamer. Zodra muggen zijn volledig verdoofd, breng ze op een petrischaaltje ingebed in een ijsemmer. Soort muggen, zorgvuldig te kijken naar de buik op tekenen van een bloedmaaltijd, en gooi die dat niet deden feed. Sommige muggen wordt volledig gezwollen terwijl anderen zullen een smalle band van ingeslikt bloed te zien, alle aanvaardbaar zijn als "gevoed". Leg de gevoed muggen in de kartonnen bekers.
- Zorg voor een suiker eten (een stuk katoen gedrenkt in 10% sucrose) aan muggen en incubeer onder normale omstandigheden insectary gedurende 7 dagen. Elke dag moet de muggen gecontroleerd worden op het sterftecijfer. Ook moet de katoen nat worden gemaakt met de sucrose, zodat ze niet verstoken zijn van voedsel. Het is beter, maar toch, op een papieren handdoek gedrenkt in gedestilleerd water toe te voegen, houden de muggen vochtig. Deze muggen zijn P. falcipraum besmet, dus alle zorg moet worden genomen zodat er geen muggen kunnen ESCAPe uit de beker. Het beste is om de cups in een kleine cagefor dubbele bescherming.
C. ontleden mug midguts en het inschatten van oocysten belastingen:
- Aspireren muggen (van stap B) van karton cups met behulp van een batterij-aangedreven aspirator. Verdoven muggen, die zich binnen de verwijderbare aspirator reservoir, door te verhuizen naar een koude kamer of het begraven van de reservoir in ijs gedurende minstens 5 minuten of tot muggen stoppen met bewegen.
- Overdracht onder narcose muggen uit het reservoir naar een glazen petrischaal ingebed in ijs. Spreid de muggen op een enkele laag en dek af met een plastic petrischaal deksel. Muggen die niet kan worden ondergebracht op de schotel te blijven in het reservoir, die wordt teruggegeven aan koude kamer of ijs.
- Met behulp van fijne punt pincet, de overdracht van een enkele mug van de schotel naar 100 ul PBS die op een glasplaatje gemonteerd onder een dissectie microscoop. Laat de anderen behandeld in de gekoelde petrischaal.
- Met behulp van fijne punt tang, houdt muggen op de thorax en de achterste buik. Uit elkaar te trekken van het lichaam tot de middendarm is blootgesteld. Gebruik een tang om overtollig weefsel te verwijderen uit gut.The darm ziet eruit als een witte, zak-achtig lichaam. Verwijder overtollig weefsel uit de gut.Mount de darm in een well van een 12-wells glasplaatje en dompel 5-10 ul van 0,2% Mercurochroom. Squash het karkas en gooi op vochtig papier towel.Continue voor andere muggen totdat de 12-well slide is vol. Bedek de gemonteerde lef met een glazen dekglaasje aan.
- Onderzoek lef onder een lichtmicroscoop, op zoek naar ronde oöcysten die fel roze vlek tegen de duidelijke / lichtrose darmweefsel. Graaf oöcysten, opnemen en verder met de volgende monster. Blijven voor alle muggen van alle experimentele behandelingen.
- Wanneer u klaar bent, veegt glijbaan schoon met een papieren handdoek. Plaats het papier handdoek met lef, en papier handdoek met karkassen, in kleine Biohazard tas en gooi in de prullenbak. Handschoenen worden gedragen gedurende de procedure. Er wordt op gelet dat er geen geïnfecteerde muggen te laten ontsnappen.
Discussion
Kunnen er een aantal variaties in de Plasmodium infectie en besmetting fenotype vastberadenheid en verschillende labo's kunnen volgen verschillende technieken.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
