Summary
Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für Malaria identifiziert wird, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung Plasmodium-Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Plasmodium-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für die Vorbereitung der gametocyte Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.
Abstract
Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für Malaria identifiziert wird, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung Plasmodium-Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Plasmodium-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für die Vorbereitung der gametocyte Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.
Protocol
A. Herstellung von gametocyte Kultur:
- Bringen Sie frischen menschlichen Blut und Serum auf 37 o C in einem Wasserbad.
- In einem Abzug, unter sterilen Bedingungen, pipet 1 ml warmes Blut in ein Eppendorf-Röhrchen. Drehen Sie das Blut in eine Zentrifuge für 5 Minuten bei 2200 Umdrehungen pro Minute. Erythrozyten sollten pelletiert; entfernen und entsorgen das klare Serum. Wash Erythozyten mit dem gleichen Volumen der neuen Serum 3 mal das ganze Blut für die gametocytes erhalten.
- Rufen Sie die gametocyte Kultur aus dem CO 2-Inkubator oder Windlicht. Diese Kultur sollte auf RPMI Medien und gefüttert, um die Mücken am Tag 16 der Kultur gepflegt werden. Zur Bestimmung der gametocytemia% (am Tag 16 der Kultur) eine dünne Schicht auf eine Glasplatte mit einem Tropfen Blut und führen Sie eine Geimsa Fleck. Bestimmen Sie die Anzahl der Gameten in einem Feld des Parasiten Kultur. Es ist in der Regel im Bereich von 2 bis 4%. Berechnen Sie das Volumen von Vollblut, die Sie benötigen, um die gewünschte endgültige% gametocytemia (0,3 -1%) zu erreichen.
- Entfernen Sie die meisten Medien von Ihrem gametocyte Kultur mit einer Pipette, dabei nicht zu stören oder zu saugen die Parasiten (Schmarotzer erscheint als schwarz, während die Medien werden rosa / rot). Pipettieren der Rest der Medien und Parasiten in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. Spin in einer Zentrifuge für 5 Minuten bei 2200 Umdrehungen pro Minute. Parasiten und Erythrozyten Pellet, entfernen und entsorgen Medien Überstand ohne störende Parasiten.
- Kombinieren Parasiten mit dem Volumen der vorbereiteten Vollblut (aus Schritt A2), um Ihnen die gewünschte endgültige gametocytemia nach den bisherigen Berechnungen. Pipettieren gründlich mischen. (~ 1 Minute)
Dies ist nun das Beispiel, das Sie zu Ihrem Mücken ernähren. Halten bei 37 o C in einem Wasserbad.
B. Fütterung Moskitos:
- Legen Sie Ihre Anopheles-Mücken (~ 30-50) in Wachs ausgekleideten Karton Tassen mit Netzgewebe durch ein Gummiband oder Pappdeckel mit Becher geliefert gesichert abgedeckt. Wir verwenden eine batteriebetriebene Sauger für diesen Schritt.
- Bereiten Sie die Durchblutung Wasserbad durch Einfügen Düsen auf beiden Seiten des Glases Zubringer zu Gummischlauch. Schließen Sie so viele Anleger, wie Sie in einer Reihe müssen, ein Ende der Serie sollte durch Schlauch mit dem Thermostat des Wasserbades (der Teil, Wasser drückt durch den Zubringer) angeschlossen werden, sollten Sie das andere Ende der Reihe von Gummischlauch bestehen untergetaucht in der Wanne, damit der Kreislauf Wasser leer zurück ins Bad. Schalten Sie das Bad, bis das Wasser etwa 37 o C und das Wasser wird durch den Anleger im Umlauf und zurück in die Badewanne. Dies ist notwendig, um das Blut warm zu halten und halten die Parasiten am Leben.
- Bereiten Sie die Membran (wir kleine Quadrate gestreckt Parafilm) durch Strecken rund um die Glasmembran Anleger, mit Druck dicht zu verschließen, um die Zuführung Öffnung. Diese Membran wird imitieren die Haut.
- Legen Sie einen Feeder-Membran-Seite nach unten auf die einzelnen Moskito-Cup und sichere Anleger mit Klammern oder Klebeband. Die Membran sitzen sollte mit dem Netz bündig so Mücken kann man aus dem Inneren der Tasse zugreifen.
- Sorgfältig Pipette Parasiten Blutmahlzeit (aus Schritt A5) in den Hals des Anlegers, so dass das Blut geht den ganzen Weg durch den Hals in das Reservoir, Kontaktierung der Membran, so dass die Mücken das Blut zugreifen können. Wir verwenden etwa 200 ul Blut pro System, aber das kann variieren.
- Lassen Mücken zu füttern. Wir können sie für ≈ 30 Minuten Feed (variabel, je nach theexperiment; für die meisten Experimente, gelegentlich kontrollieren, wie viele haben bereits eine Mahlzeit suchen Sie in das Blut-Gehalt in den Bauch getroffen.)
- Nach der Fütterung, Abrüsten von der Mücke Tassen. Schalten Sie das Wasserbad und ziehen Anleger von Schläuchen.
- Entfernen Sie die Membran und genießen Anleger in 10% Bleichmittel zu dekontaminieren und mit Wasser abspülen. Kontaminierte Materialien (Membranen, Papiertücher, Handschuhe, etc.) in einen kleinen Beutel für biologisches Risikomaterial und Einzahlung in einen großen Behälter biohazard.
- Anesthetize Mücken, indem Tassen im Kühlschrank oder Kühlraum. Sobald Mücken sind voll narkotisiert, übertragen Sie sie auf eine Petrischale in einem Eiskübel eingebettet. Sortieren Moskitos, suchen Sie genau auf den Bauch auf Anzeichen einer Blutmahlzeit, und entsorgen Sie diejenigen, die nicht eingezogen hat. Einige Moskitos voll engorged werden, während andere ein schmales verzehrte Blut zeigen wird, alle sind akzeptabel, "gefüttert". Legen Sie die gefüttert Moskitos wieder in den Pappbecher.
- Geben Sie einen Zucker essen (ein Stück Baumwolle in 10% Saccharose eingeweicht), um Mücken, und inkubieren unter normalen Bedingungen Insektarium für 7 Tage. Jeden Tag sollten die Mücken für die Sterblichkeitsrate überwacht werden. Auch sollte die Baumwolle nass mit der Saccharose werden, so dass sie nicht die Nahrung entzogen. Es ist besser, noch ein Papiertuch in destilliertem Wasser getränkt hinzuzufügen, zu halten die Mücken feucht. Diese Mücken sind P. falcipraum infiziert, so dass alle darauf geachtet werden muss, damit keine Mücken können escape aus dem Becher. Am besten ist es die Tassen in einem kleinen cagefor doppelten Schutz zu stellen.
C. Dissecting Mücke Mitteldärmen und Schätzung oocyst Lasten:
- Absaugen Mücken (aus Schritt B) aus Pappbecher mit einer Batterie betrieben Aspirator. Anesthetize Mücken, die in dem herausnehmbaren Aspirator Reservoir sind, indem sie zu einem kalten Raum oder Vergraben des Reservoirs in Eis für mindestens 5 Minuten oder bis Mücken nicht mehr bewegt.
- Transfer betäubt Mücken aus dem Reservoir zu einer Glas-Petrischale in Eis eingebettet. Verbreiten Sie die Mücken zu einer einzigen Schicht und Abdeckung mit einer Kunststoff-Petrischale Deckel. Mücken, die nicht auf den Teller untergebracht werden können bleibt im Behälter, die kalten Raum oder Eis zurückgekehrt ist.
- Mit spitzen Pinzette, Übertragung einer Mücke aus der Schüssel zu 100 ul PBS auf einem Objektträger unter einem Dissektionsmikroskop montiert enthalten. Lassen Sie die anderen in der gekühlten Petrischale abgedeckt.
- Mit spitzen Pinzette, halten Mücken an der Brust und der hintere Bauch. Ziehen Sie den Körper auseinander, bis die Mitteldarm ausgesetzt ist. Verwenden einer Pinzette, um überschüssiges Gewebe aus gut.The gut entfernen sieht aus wie eine weiße, sackartige Körper. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe aus der gut.Mount den Darm in eine Vertiefung einer 12-well Objektträger aus Glas und tauchen in 5-10 ul von 0,2% Mercurochrom. Squash die Karkasse und entsorgen auf feuchtem Papier towel.Continue für andere Mücken, bis der 12-Well-Rutsche ist voll. Bedecken Sie den Mut montiert mit einem Deckglas.
- Untersuchen Sie Mut unter einem Lichtmikroskop auf der Suche nach runden Oozysten, die leuchtend rosa gegen den klaren / zartrosa Darmgewebe Fleck. Graf Oozysten, aufnehmen und weiter auf die nächste Probe. Weiter für alle die Moskitos aus allen experimentellen Behandlungen.
- Wenn Sie fertig sind, wischen Sie gleiten sauber mit einem Papiertuch. Legen Sie das Papiertuch mit Mut und Papiertuch mit Kadavern, in kleine Beutel für biologisches Risikomaterial und entsorgen Sie in den Papierkorb. Handschuhe sind im gesamten Verfahren getragen. Es wird darauf geachtet, keine infizierten Mücken entweichen zu lassen.
Discussion
Es kann einige Variationen in der Plasmodium-Infektion und Infektion Phänotyp Bestimmung und verschiedenen Labors unterschiedliche Techniken zu folgen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
