Summary
Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistentes a la malaria, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones por Plasmodium en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de la infección por Plasmodium de mosquitos se puede probar. Las técnicas para la preparación del cultivo de gametocitos, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.
Abstract
Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistentes a la malaria, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones por Plasmodium en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de la infección por Plasmodium de mosquitos se puede probar. Las técnicas para la preparación del cultivo de gametocitos, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.
Protocol
A. Preparación de la cultura de gametocitos:
- Llevan la sangre humana fresca y suero a 37 º C en un baño de agua.
- En una campana de extracción, bajo condiciones estériles, pipetas de 1 mL de sangre caliente en un tubo eppendorf. Haga girar la sangre en una centrifugadora durante 5 minutos a 2200 rpm. Eritrocitos se sedimentan, retirar y desechar el suero. Lavado de eritrocitos con un volumen igual de suero de nuevo 3 veces para obtener la sangre de los gametocitos.
- Recuperar la cultura de gametocitos de la incubadora de CO2 o un tarro de velas. Esta cultura se debe mantener en medio RPMI y se alimenta a los mosquitos en el día 16 de la cultura. Para determinar el% gametocytemia (el día 16 de la cultura) que una capa delgada sobre un portaobjetos con una gota de sangre y realizar una Geimsa mancha. Determinar el número de gametos en un campo de cultivo de parásitos. Por lo general, en el rango de 2 a 4%. Calcular el volumen de sangre total que se necesita para lograr el deseado gametocytemia% final (0,3 -1%).
- Eliminar la mayor parte de los medios de comunicación de su cultura gametocitos utilizando una pipeta, teniendo cuidado de no perturbar o absorben los parásitos (parásitos aparecerá como negro, mientras que los medios de comunicación será la luz de color rosa / rojo). Pipeta el resto de los medios de comunicación y los parásitos en un tubo de 15 ml halcón. Girar en una centrífuga durante 5 minutos a 2200 rpm. Parásitos y eritrocitos de pellets, quite y deseche los medios de comunicación sobrenadante sin perturbar los parásitos.
- Combine los parásitos con el volumen de sangre total preparado (de paso A2) para darle la gametocytemia final deseado de acuerdo a los cálculos anteriores. Pipeta para mezclar bien. (~ 1 minuto)
Esta es ahora la muestra que se alimentan a su mosquitos. Mantener a 37 º C en un baño de agua.
B. mosquitos Alimentación:
- Ponga su mosquitos Anopheles (~ 30-50) en vasos de cartón forrado de cera cubierta con red de malla asegurada por una banda de goma o una tapa de cartón suministrado con la taza. Nosotros usamos un aspirador a pilas para este paso.
- Prepare la circulación del agua de baño de la inserción de las boquillas en ambos lados de los alimentadores de vidrio para tubo de goma. Conecte como alimentadores que necesite de una serie, un extremo de la serie debe estar conectado mediante un tubo al termostato del baño de agua (la parte que empuja el agua a través de los comederos), el otro extremo de la serie debe consistir en un tubo de goma sumergido en el baño para que el agua distribuida a vaciar de nuevo en el baño. A su vez en el baño hasta que el agua es de unos 37 º C y el agua circule a través de los alimentadores y de vuelta al baño. Esto es esencial para mantener caliente la sangre y mantener los parásitos vivos.
- Prepare la membrana (nosotros usamos pequeños cuadrados de estirado parafina) se extiende por todo el alimentador de membrana de vidrio, utilizando la presión para sellar herméticamente la apertura del alimentador. Esta membrana se imitan la piel.
- Coloque un alimentador de la membrana hacia abajo en cada taza de mosquitos y alimentadores seguro utilizando grapas o cinta adhesiva. La membrana debe sentarse al ras de la red para que los mosquitos pueden acceder a él desde el interior de la taza.
- Cuidadosamente pipeta parásitos harina de sangre (de paso A5) en el cuello de la alimentación, lo que hace que la sangre recorre todo el camino a través del cuello en el depósito, en contacto con la membrana que los mosquitos pueden tener acceso a la sangre. Usamos unos 200 l de sangre por cada alimentador, pero esto puede variar.
- Permita que los mosquitos se alimentan. Permitimos que la alimentación de ≈ 30 minutos (variable, dependiendo de theexperiment, para la mayoría de los experimentos, de vez en cuando el seguimiento de cómo muchos ya han tomado una comida mirando el contenido de sangre en el abdomen.)
- Después de la alimentación, retire los alimentadores de las copas de los mosquitos. Apague el baño de agua y desconecte los alimentadores de la tubería.
- Quitar la membrana y disfrutar alimentadores en 10% de lejía para desinfectar y enjuagar con agua. Coloque el material contaminado (membranas, toallas de papel, guantes, etc) en una pequeña bolsa de riesgo biológico y depositar en un recipiente grande de riesgo biológico.
- Anestesiar a los mosquitos mediante la colocación de vasos en el refrigerador o cuarto frío. Una vez que los mosquitos son totalmente anestesiado, su transferencia en una placa de Petri incrustados en un cubo de hielo. Ordenar los mosquitos, mirando cuidadosamente el abdomen para detectar cualquier signo de una harina de sangre, y desechan las que no se alimentan. Algunos mosquitos serán completamente llena de sangre, mientras que otros muestran una estrecha banda de sangre ingerida, y todos son aceptables como "alimentado". Ponga los mosquitos pasan a engrosar la vasos de cartón.
- Proporcionar una comida de azúcar (un trozo de algodón empapado en 10% de sacarosa) a los mosquitos, y se incuba en condiciones normales de insectario durante 7 días. Todos los días, los mosquitos deben ser monitorizados por la tasa de mortalidad. Además, el algodón debe ser mojado con la sacarosa, por lo que no se les prive de los alimentos. Es mejor, sin embargo, al añadir una toalla de papel empapada en agua destilada, para mantener a los mosquitos húmedo. Estos mosquitos son P. falcipraum infectados, por lo que todos se debe tener cuidado para que no los mosquitos pueden escape de la copa. Lo mejor es poner los vasos en una protección cagefor doble pequeña.
C. Disección midguts mosquito y la estimación de las cargas de ooquistes:
- Aspirar los mosquitos (desde el paso B) de vasos de cartón con un aspirador a pilas. Anestesiar a los mosquitos, que son en el interior del depósito de aspiración extraíble, al mudarse a una habitación fría o enterrar el depósito de hielo durante al menos 5 minutos o hasta que los mosquitos dejen de moverse.
- La transferencia de los mosquitos anestesiado desde el depósito hasta un plato de Petri de vidrio incrustados en el hielo. Propagación de los mosquitos de una sola capa y cubrir con una tapa de plato de plástico Petri. Los mosquitos que no se pueden acomodar en el plato de permanecer en el depósito, que se devuelve a la habitación fría o hielo.
- Utilizando unas pinzas de punta fina, la transferencia de un solo mosquito de la antena a 100 ul PBS contenida en un portaobjetos de vidrio montada en un microscopio de disección. Deja a los demás incluidos en el frío plato de petri.
- Utilizando unas pinzas de punta fina, mantener los mosquitos en el tórax y el abdomen posterior. Tire del cuerpo del otro hasta el intestino medio está expuesto. El uso de fórceps para extraer el exceso de tejido del intestino gut.The se parece a un blanco, en forma de saco del cuerpo. Retire el exceso de tejido de la gut.Mount el intestino en un pocillo de una placa de vidrio de 12 bien y sumergirse en l 50-10 del 0,2% mercurocromo. Aplastar el cuerpo y desechar el towel.Continue de papel húmeda para otros mosquitos hasta que la diapositiva de 12 y está lleno. Cubren las agallas montado con un cubreobjetos.
- Examinar las entrañas con un microscopio de luz, en busca de ooquistes ronda que se tiñen de color rosa brillante contra el tejido intestinal claro / rosa tenue. Contar con los ooquistes, registrar y seguir a la siguiente muestra. Seguir para todos los mosquitos de todos los tratamientos experimentales.
- Cuando haya terminado, pase de diapositivas limpiar con una toalla de papel. Coloque la toalla de papel con las tripas, y una toalla de papel con cadáveres, en la bolsa de riesgo biológico pequeñas y desechar en la basura. Se usan guantes durante todo el procedimiento. Hay que tener cuidado de no dejar que nadie se escape de mosquitos infectados.
Discussion
No puede haber algunas variaciones en la infección por Plasmodium y determinación fenotipo infección y los diferentes laboratorios pueden seguir diferentes técnicas.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
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