Summary
유전자가 말라리아에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 이내 Plasmodium 감염을 예방의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 plasmodium 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. gametocyte 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액을 준비하고 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.
Abstract
유전자가 말라리아에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 이내 Plasmodium 감염을 예방의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 plasmodium 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. gametocyte 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액을 준비하고 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.
Protocol
gametocyte 문화의 A. 준비 :
- 신선한 인간의 혈액과 물 목욕 37 O C에 혈청을 가져와.
- 무균 조건, pipet eppendorf 튜브에 따뜻한 혈액 1 ML 아래 퓸 후드에. 2,200 rpm으로 5 분간 원심 분리기에서 혈액을 돌려. 적혈구는 pelleted되어야하며 맑은 혈청을 제거하고 폐기. gametocytes에 대한 전체 혈액을 얻기 위해 새로운 혈청 3 회 중 동일한 볼륨 erythocytes 씻으십시오.
- CO 2 배양기 또는 캔들 병에서 gametocyte 문화를 검색할 수 있습니다. 이 문화는 문화 일 16 일 모기에 RPMI 미디어 및 방송에서 유지 관리해야합니다. gametocytemia %를 (문화의 날 16 일)를 확인하려면 한방울의 피가있는 유리 슬라이드에 얇게 얼룩을 만들고 Geimsa 얼룩도 수행합니다. 기생충 문화의 분야에서 gametes의 수를 결정합니다. 그것은 2의 범위에서 일반적으로있다 - 4 %. 당신이 원하는 마지막 %의 gametocytemia (0.3 -1 %)를 달성해야합니다 전체 혈액의 볼륨을 계산합니다.
- , pipet을 사용하여 gametocyte 문화 미디어의 대부분을 제거 방해하거나 기생충을 빨아 (미디어가 빨강 / 분홍 빛이 될 동안 기생충과 같이 검정색 나타납니다)하지 돌보는. 15 ML 팔콘 튜브에 미디어와 기생충의 나머지 Pipet. 2,200 rpm으로 5 분간 원심 분리기에 돌려. 기생충과 적혈구는 펠렛은, 제거 및 방해 기생충없이 뜨는 미디어 삭제됩니다.
- 당신에게 이전 계산에 따르면 원하는 최종 gametocytemia 줄 준비가 전체 혈액의 볼륨 (단계 A2에서)와 기생충을 결합합니다. 철저하게 섞어 Pipet. (~ 1 분)
이것은 지금 당신이 모기에 피드됩니다 예제입니다. 물이 욕조에서 37 O C에서 보관.
B. 먹이 모기 :
- 메쉬가 고무 밴드 또는 컵와 함께 제공된 판지 뚜껑을 확보할 수 그물로 덮여 왁스 늘어선 종이 컵에 아노 펠 레스 모기 (~ 30-50) 넣어. 우리는이 단계의 배터리로 작동하는 흡인기를 사용합니다.
- 고무 튜브에 유리 모이통의 양쪽에 노즐을 삽입하여 순환 물 목욕을 준비합니다. 당신이 일련의 필요로 많은 모이통으로 연결하며 일련의 한쪽 끝을은 물 목욕 (피더를 통해 물들을 못살게 굴지되는 부분)의 유통자에 튜브로 연결되어 있어야합니다,이 시리즈의 다른 쪽 끝을는 고무 튜브로 구성해야 순환 물을 욕조에 다시 빈 수 있도록 욕조에 빠져들. 물 37에 대해 O C와 물을 욕조에 다시 피더를 통해 순환하고있다 때까지 목욕을 켭니다. 이것은 혈액 따뜻하게 유지하고 기생충이 살아있게하는 것이 필수적입니다.
- 피더 오프닝에 단단히 밀봉 압력을 사용하여 유리 막 피더 주변 스트레칭하여 세포막을 (우리가 늘어 parafilm 작은 사각형을 사용하는) 준비. 이 막이 피부 역할을하게 될 것입니다.
- 플레이스 각 모기 컵 및 클램프 또는 테이프를 사용하여 보안 모이통에 한 피더 막 측 다운. 모기는 컵 내부에서 액세스할 수 있도록 막이 그물을 잔뜩 앉아해야합니다.
- 피더의 목에 조심스럽게 피펫 기생충 - 혈액 식사 (단계 A5에서), 혈액이 모기가 피를에 액세스할 수 있도록 멤브레인 문의, 저수지에 목을 처음부터 끝까지 간다 확실히 하려구요. 우리는 피더 당 혈액 200 μl에 대해 사용할 수 있지만이 다를 수 있습니다.
- 모기가 먹이를 허용합니다. 우리는 그들이 ≈ 30 분 동안 먹을 수있게 (theexperiment에 따라 변수를, 대부분의 실험을 위해, 때로는 얼마나 많은가 이미 복부에있는 혈액의 콘텐츠를보고 식사를 데리고 모니터링.)
- 수유 후, 모기 컵에서 피더를 제거합니다. 물 목욕을 끄고 튜브에서 모이통 연결을 끊습니다.
- 멤브레인를 제거하고 오염을 제거하다와 물로 씻어 10 %의 표백제에 모이통 만끽해보세요. 이곳은 많은 생물 학적 소켓에있는 작은 생물 학적 가방 보증금으로 (세포막, 종이 수건, 장갑, 등) 자료를 오염.
- 냉장고 또는 차가운 방에서 컵을 배치하여 모기를 마취. 일단 모기가 완전히 anesthetized 있으며, 얼음 양동이에 포함된 배양 접시에서 그들을 전송합니다. 정렬 모기는 혈액 식사의 기호에 대한 abdomens에서 신중하게보고하고, 피드 않았들을 폐기. 다른 사람들이 섭취 혈액의 좁은 밴드를 표시합니다 반면 어떤 모기가 완전히 부풀어 오른 것입니다, 모두는 "먹이"로 가능합니다. 종이 컵에 다시 먹은 모기 놔.
- 모기에 설탕 식사 (10 % 자당에 배어 목화의 조각)를 제공하고, 7 일 동안 정상 insectary 조건에서 알을 품다. 매일 모기가 사망률에 대한 모니터링해야합니다. 또한, 면화는 그들이 음식을 박탈하지 않도록, 자당와 젖은하여야한다. 그것은 모기가 습한 상태로 유지하려면 증류수에 담가 종이 타월을 추가하려면 아직 더 있습니다. 이러한 모기 피 아르 falcipraum 감염된 모든 관리가 더 모기가 escap 수 없을 정도로 이동해야하므로컵에서 전자. 작은 cagefor 이중 보호에 얹어하는 것이 좋습니다.
C. 모기가 midguts 분석 해 봅시다하고 oocyst의 하중을 추정 :
- 배터리로 작동하는 흡인기를 사용하여 종이 컵에서 대기음 모기 (단계 B에서). 이동식 흡인기 저수지 안에 마취 모기, 차가운 방에 이동하거나 적어도 5 분 또는 모기 중단 이동까지 얼음에있는 저수지를 압도하여.
- 저수지에서 얼음에 포함된 유리 페트리 접시에 anesthetized 모기를 전송합니다. 단일 레이어로 모기를 확산 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑이있는 표지. 접시에 숙박하실 수 없습니다 모기 추운 방 또는 얼음에 반환되는 저수지에 남아 있습니다.
- 세부적으로 밀고 집게를 사용하여 해부 현미경 아래에 탑재 유리 슬라이드에 포함된 100 UL PBS로 요리에서 단일 모기를 전송합니다. 냉장 페트리 접시에 나와 다른 둡니다.
- 세부적으로 밀고 집게를 사용하여, 흉부 및 복부 뒷부분에서 모기를 개최. midgut 노출 때까지 분리 시체를 당겨. gut.The 뱃속에서 초과 조직을 제거하는 집게를 사용하여이 흰색처럼 몸 색처럼 보인다. 0.2 %가 mercurochrome의 5-10 μl의 12 잘 유리 슬라이드 및 담가 잘 하나 gut.Mount 창자에서 여분의 조직을 제거합니다. 호박은 12 자 슬라이드 때까지 다른 모기를 위해 젖은 종이 towel.Continue에 시체와 폐기가 가득 찼습니다. 유리 coverslip으로 탑재 용기를 커버.
- 희미한 / 맑은 분홍색 굿 조직에 대한 밝은 분홍색 얼룩 원형 oocysts를 찾고, 가벼운 현미경으로 배짱을 검사합니다. , oocysts 백작 기록하고 다음 예제를 계속합니다. 모든 실험 치료에서 모기 모든 계속합니다.
- 완료되면, 종이 타월로 깨끗이 닦아 슬라이드. 작은 생물 학적 가방으로, 용기와 종이 타월, 그리고 시체와 함께 종이 타월을 놓고 쓰레기통에 폐기합니다. 장갑이 절차 전반에 걸쳐 착용합니다. 치료는 감염된 모기 탈출하게하지 않도록합니다.
Discussion
이 Plasmodium 감염 및 감염 표현형 결정에서 일부 차이를 보일 수 있으며, 다른 연구소는 다른 기술을 따라 수 있습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
