Summary
Une fois qu'un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires au paludisme, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections à Plasmodium dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l'étendue des infections à Plasmodium de moustiques peuvent être dosés. Les techniques de préparation de la culture de gamétocytes, se nourrissant de sang humain membrane moustiques, et en dosant les titres viraux dans l'intestin moyen des moustiques sont démontrés.
Abstract
Une fois qu'un gène est identifié comme étant potentiellement réfractaires au paludisme, il doit être évalué pour son rôle dans la prévention des infections à Plasmodium dans le moustique. Ce protocole illustre la façon dont l'étendue des infections à Plasmodium de moustiques peuvent être dosés. Les techniques de préparation de la culture de gamétocytes, se nourrissant de sang humain membrane moustiques, et en dosant les titres viraux dans l'intestin moyen des moustiques sont démontrés.
Protocol
A. Préparation de la culture gamétocytes:
- Apportez fraîcheur sang humain et de sérum à 37 o C dans un bain d'eau.
- Dans une hotte, dans des conditions stériles, une pipette 1 ml de sang chaud dans un tube Eppendorf. Spin le sang dans une centrifugeuse pendant 5 minutes à 2200 rpm. Les érythrocytes doivent être granulées; enlever et jeter le sérum clair. Lavez érythrocytes avec un volume égal de sérum de nouveaux 3 fois pour obtenir le sang total pour les gamétocytes.
- Récupérer la culture gamétocytes de l'incubateur CO 2 ou photophore. Cette culture doit être maintenue sur le milieu RPMI et nourris aux moustiques le jour 16 de la culture. Afin de déterminer le% gametocytemia (sur 16 jours de la culture) faire un frottis mince sur une lame de verre avec une goutte de sang et d'effectuer une Geimsa tache. Déterminer le nombre de gamètes dans un champ de la culture du parasite. Il est généralement de l'ordre de 2 - 4%. Calculez le volume de sang total que vous aurez besoin pour atteindre les gametocytemia% final souhaité (0,3 -1%).
- Enlever la plupart des médias de votre culture gamétocytes aide d'une pipette, en prenant soin de ne pas déranger ou aspirer les parasites (parasites apparaissent en noir tandis que les médias sera léger rose / rouge). Déposer le reste des médias et des parasites dans un tube Falcon de 15 ml. Spin dans une centrifugeuse pendant 5 minutes à 2200 rpm. Les parasites et les érythrocytes se granulés, retirez et jetez les médias surnageant sans parasites inquiétants.
- Combinez les parasites avec le volume de sang total préparés (à partir de l'étape A2) pour vous donner la gametocytemia finale désirée, selon les calculs précédents. Pipet pour bien mélanger. (~ 1 minute)
C'est maintenant l'échantillon, vous nourrir vos moustiques. Gardez à 37 o C dans un bain-marie.
Nourrir les moustiques B.:
- Mettez votre moustiques Anopheles (~ 30-50) dans des tasses en carton paraffiné recouvert de maille filet garanti par une bande de caoutchouc ou d'un couvercle en carton fourni avec la tasse. Nous utilisons un aspirateur à piles pour cette étape.
- Préparer la circulation au bain-marie en insérant des buses de chaque côté de mangeoires de verre pour tubes en caoutchouc. Connectez que les mangeoires que vous avez besoin d'une série; une extrémité de la série devrait être raccordé à un tube au circulateur du bain d'eau (la partie qui pousse l'eau à travers les mangeoires), l'autre extrémité de la série devrait être composé de tubes en caoutchouc immergé dans le bain pour permettre à l'eau distribuée à vide dans le bain. Allumez le bain jusqu'à ce que l'eau est d'environ 37 o C et l'eau circule à travers les mangeoires et de retour à la baignoire. Cela est essentiel pour conserver la chaleur du sang et de garder les parasites vivants.
- Préparer la membrane (nous utilisons des petits carrés de parafilm étiré) en étirant dans le chargeur de la membrane de verre, en utilisant la pression pour sceller hermétiquement à l'ouverture d'alimentation. Cette membrane va imiter la peau.
- Placez une mangeoire à membrane vers le bas sur chaque tasse de moustiques et de mangeoires sécuriser l'aide de colliers ou de ruban adhésif. La membrane doit s'asseoir au ras du filet afin moustiques peuvent y accéder de l'intérieur de la tasse.
- Soigneusement pipette parasites sanguins repas (A5 étape) dans le col de l'alimentation, en s'assurant que le sang va tout le chemin à travers le cou dans le réservoir, contact avec la membrane de sorte que les moustiques peuvent accéder au sang. Nous utilisons environ 200 ul de sang par départ, mais cela peut varier.
- Autoriser les moustiques de se nourrir. Nous leur permettons de se nourrir pendant ≈ 30 minutes (variable selon theexperiment; pour la plupart des expériences, parfois surveillance combien ont déjà pris un repas en regardant le contenu de sang dans l'abdomen.)
- Après l'alimentation, retirer mangeoires de la tasse de moustique. Eteignez le bain d'eau et débranchez mangeoires à partir de tubes.
- Retirer la membrane et laisser tremper dans l'eau de Javel mangeoires de 10% pour décontaminer et rincer à l'eau. Placez les matières contaminées (membranes, des serviettes en papier, gants, etc) dans un petit sac de Biohazard et déposer dans un grand récipient Biohazard.
- Anesthetize moustiques en plaçant coupes au réfrigérateur ou chambre froide. Une fois que les moustiques sont complètement anesthésiés, les transférer sur une boîte de Pétri incorporé dans un seau à glace. Trier les moustiques, en regardant attentivement les abdomens de tout signe d'un repas de sang, et de jeter ceux qui ne se nourrissent pas. Certains moustiques seront entièrement gorgée tandis que d'autres montrent une bande étroite de sang ingéré, tous sont acceptables comme «nourris». Mettez les moustiques nourris dans les gobelets en carton.
- Offrir un repas de sucre (un morceau de coton imbibé de 10% de saccharose) pour les moustiques, et incuber dans des conditions normales insectarium pendant 7 jours. Chaque jour, les moustiques doivent être surveillés pour le taux de mortalité. En outre, le coton doit être fait mouiller avec le saccharose, de sorte qu'ils ne soient pas privés de nourriture. Il vaut mieux, encore, d'ajouter une serviette de papier imbibée d'eau distillée, pour éloigner les moustiques humide. Ces moustiques sont P. falcipraum infectés, de sorte que tous les soins doivent être prises afin que les moustiques peuvent pas CESAPe de la coupe. Il est préférable de mettre les tasses en une protection cagefor double petit.
C. Dissection estomacs des moustiques et l'estimation des charges oocystes:
- Aspirer les moustiques (de l'étape B) de gobelets carton à l'aide d'un aspirateur à piles. Anesthetize moustiques, qui sont à l'intérieur du réservoir d'aspiration amovible, en se déplaçant à une chambre froide ou d'enterrer le réservoir dans la glace pendant au moins 5 minutes ou jusqu'à ce que les moustiques arrêter de bouger.
- Transfert moustiques anesthésiés à partir du réservoir d'un plat en verre de Pétri intégrés dans la glace. Fais les moustiques à une seule couche et couvrir avec un couvercle de Petri en plastique. Les moustiques qui ne peuvent pas être logés sur le plat reste dans le réservoir, qui est retourné à chambre froide ou de glace.
- En utilisant une pince à pointe fine, transférer un seul moustique de l'antenne à 100 ul de PBS contenues sur une lame de verre montée sous un microscope à dissection. Laissez les autres couverts dans le plat refroidi Pétri.
- En utilisant une pince à pointe fine, tenir les moustiques au niveau du thorax et l'abdomen postérieur. Tirez sur le corps de l'autre jusqu'à l'intestin moyen est exposé. Utilisez une pince pour enlever l'excès de tissu de l'intestin gut.The ressemble à un blanc, en forme de sac corps. Retirer l'excès de tissu de la gut.Mount l'intestin dans un puits d'une lame de verre de 12 puits et de plonger dans ul 5-10 de 0,2% du mercurochrome. Squash de la carcasse et les jeter sur le papier humide towel.Continue pour les moustiques d'autres jusqu'à ce que la glissière de 12 puits est plein. Couvrir les tripes monté avec une lamelle de verre.
- Examinez tripes d'un microscope optique, à la recherche d'oocystes ronds cette tache rose vif contre le tissu clair / faibles intestinale rose. Comptez oocystes, enregistrer et continuer à l'échantillon suivant. Continuer pour tous les moustiques de tous les traitements expérimentaux.
- Lorsque vous avez terminé, essuyez lame propre avec une serviette en papier. Placer la serviette de papier avec des tripes, et serviette en papier avec les carcasses, dans le sac et jetez Biohazard petite à la poubelle. Les gants sont portés pendant toute la procédure. Il est pris soin de ne pas laisser échapper aucun des moustiques infectés.
Discussion
Il peut y avoir quelques variations dans l'infection à Plasmodium et de la détermination phénotype infection et différents laboratoires peuvent suivre différentes techniques.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Anopheles | Animal | mosquitos | ||
| Plasmodium falciparum | Animal | Parasite. Gametocytes with known gametocytemia. | ||
| 15 mL conical tubes | plastic | |||
| Serum, blood | human, O+ | |||
| 0.2% mercurochrome | ||||
| glass-slide | 12 well | |||
| light microscope | ||||
| cell counter | ||||
| 10% bleach | ||||
| pipette tips | for tissue culture | |||
| parafilm | ||||
| mosquito feeder | glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders | |||
| Petri dishes | slass | |||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | buffer | 1X, sterile | ||
| circulating water bath | ||||
| pipetteman | ||||
References
- Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
