Summary
Questo protocollo descrive un metodo non-virale di consegna di costrutti genetici per una certa area del cervello dei roditori viventi. Il metodo consiste di preparazione plasmide, fabbricazione micropipetta, chirurgia neonatale dei cuccioli di ratto, microiniezione del costrutto, e
Abstract
Creazione di animali transgenici è un approccio standard per studiare le funzioni di un gene di interesse in vivo. Tuttavia, molti knockout o animali transgenici non sono sostenibili a quei casi in cui viene espresso il gene modificato o cancellato in tutto l'organismo. Inoltre, una varietà di meccanismi di compenso spesso rendono difficile l'interpretazione dei risultati. Gli effetti di compensazione può essere alleviato con tempismo sia l'espressione genica o limitando la quantità di cellule transfettate.
Il metodo di postnatale non-ventricolare microiniezione e elettroporazione in vivo permette somministrazione mirata di geni, molecole di colorante siRNA o direttamente a una piccola regione di interesse nel cervello dei roditori neonato. In contrasto con tecnica convenzionale iniezione ventricolare, questo metodo permette di trasfezione di non-migratori tipi di cellule. Animali trasfettate mediante il metodo descritto qui può essere utilizzato, ad esempio, per i due fotoni imaging in vivo o in esperimenti elettrofisiologici su sezioni di cervello acuto.
Protocol
1. Introduzione
Creazione di animali transgenici è un potente metodo di indagine delle funzioni dei geni in animali vivi 1 e per il meccanismo di svelare la malattia 2,3 così come per manipolare le proprietà delle cellule 4. Tuttavia, la procedura è piuttosto laboriosa, estremamente lunga e costosa, così da giustificare l'uso di metodi alternativi consegna del gene virale come l'iniezione 5, iniezione ventricolare neonatale con elettroporazione 6 e in utero elettroporazione 7,8. Il metodo di postnatale non-ventricolare di iniezione ed elettroporazione è un insieme unico di vantaggi: uso di costrutti genetici non virali; possibilità di creare un modello di espressione locale della zona di interesse; in situ di transfezione non migratorie tipi di cellule, ad esempio corticale astrociti.
In questo video, dimostriamo la procedura dettagliata di consegna del gene postnatale al cervello di ratto neonatale utilizzando un plasmide codifica per la proteina fluorescente verde potenziato da un promotore di pollo beta actina con CMV enhancer (pCAG-EGFP) 9. Illustriamo la preparazione del plasmide contenente soluzione iniettabile, la produzione di pipette di vetro sottile e montaggio delle microinjector su uno strumento stereotassico. Poi si parla di anestetizzante ratti con isoflurano, circa l'effettuazione dell'intervento, in merito alla procedura di iniezione e sulla elettroporazione utilizzando elettrodi forcipe e in porator vivo. Infine, abbiamo brevemente i risultati attesi, le prospettive e le difficoltà che possono sorgere durante questi esperimenti.
2. Preparazione plasmide per elettroporazione
- Noi di solito preparare 10 ml di soluzione per l'iniezione plasmide in un tubo di 200 l parete sottile. Questa soluzione è sufficiente per alcuni esperimenti.
- Noi mix 8 microlitri della soluzione del plasmide (vedi Materiali e attrezzature) con 1 microlitri della PBS 10X (vedi Materiali e attrezzature) e 1 ml di soluzione allo 0,1% Veloce acqua verde (vedi Materiali e attrezzature).
- La concentrazione finale del plasmide nella soluzione iniettabile deve essere compreso tra 1 e 3 mg / mL. Concentrazioni più basse di DNA plasmidico riduce l'efficienza di transfezione, mentre la più alta concentrazione di DNA sarà troppo viscoso per l'iniezione attraverso la punta sottile del vetro capillare.
3. Vetro Ago Preparazione
- Per la preparazione pipetta di vetro, si usa vetro borosilicato capillare con un filamento (vedi Materiali e attrezzature) e una verticale estrattore elettrodo di vetro (vedi Materiali e attrezzature) per la massima trazione e riscaldamento parametri.
- Abbiamo poi rompere la punta della pipetta con un pezzo di carta per ottenere una punta di 10-20 micron di diametro.
- Controlliamo il diametro punta e forma sotto l'obiettivo microscopio.
4. Microinjector Assemblaggio
- Usando un sottile polimero capillare (vedi Materiali e attrezzature) abbiamo riempire circa 1 / 3 del volume di un 10 microlitri Hamilton siringa (vedere Materiali e attrezzature) con olio minerale (vedi Materiali e attrezzature). Evitare bolle d'aria!
- Poi abbiamo riempire la pipetta di vetro con olio minerale e inserire la pipetta nella siringa Hamilton. Evitare bolle d'aria!
- La siringa di vetro con pipetta viene poi fissata sul microinjector collegati a un controller (vedi Materiali e attrezzature).
- Il setup microiniezione fisso su uno strumento stereotassico (vedi Materiali e attrezzature) ci permette di immergere in tutta sicurezza la punta della pipetta di vetro nella provetta con la soluzione di iniezione plasmide.
- Quando la punta tocca la superficie della soluzione, immergetelo millimetri ulteriormente da 1 o 2 e riempire la pipetta con circa 1 ml della miscela di iniezione iniettore con il micro controller.
5. Animali anestetizzante
Tutte le procedure qui presentate sono state eseguite secondo l'Università di Helsinki regolamenti per gli esperimenti sugli animali.
- Per ogni esperimento, riempire una siringa a tenuta di gas (vedi Materiali e attrezzature) con circa 2 ml di isoflurano (vedi Materiali e attrezzature).
- Che la siringa è fissato sull'unità anestesia (vedi Materiali e attrezzature) collegato alla sorgente del flusso d'aria, la finestra di animali e la maschera fissa sulla configurazione stereotassica.
- Sull'unità anestesia, correggiamo il flusso d'aria a circa 250 ml / min e il livello di isoflurano al 4%.
- Abbiamo posto il topo cucciolo nella casella di animali per 2-5 minuti.
- Quando il cucciolo smette di muoversi, posto sulla rampa di riscaldamento (vedi Materiali e attrezzature) collegato alla configurazione stereotassica.
- Inserire una parte rostrale del cucciolo la testa nella maschera anestetizzante.
- Ci vogliono 5 a 10 minuti per ilcucciolo di entrare nel anestesia profonda.
- Controllare profondità dell'anestesia con un pizzico di coda e diminuire l'afflusso isoflurano a circa 1,5 al 2,0%.
6. Chirurgia, microiniezione e Elettroporazione
- Trattare la pelle del cucciolo testa con l'etanolo al 70%.
- Utilizzando piccole forbici (vedi Materiali e attrezzature) e pinze sottili (vedi Materiali e attrezzature), tagliare la pelle da un collottola del cucciolo alla sua fronte.
- Piegare pezzi pelle lateralmente e tirare le barre orecchio leggermente in orifizi sonora del cranio per la testa e la fissazione della pelle.
- Utilizzando un microscopio binoculare, abbiamo individuare il punto bregma sul cranio.
- Identificare la regione di interesse utilizzando le coordinate stereotassica.
- Posizionare la pipetta di iniezione di sopra di questa regione e contrassegnarlo facendo cadere 25-50 nl della soluzione iniettabile sulla superficie del cranio.
- Forare il cranio con delicatezza e attenzione nel punto segnato con un trapano ad alta velocità chirurgico (vedi Materiali e attrezzature) al microscopio fino liquido appare nell'area forato.
- Fissa un elettrodi electropotation pinza (vedi Materiali e attrezzature) ai lati del cranio con gel conduttore di corrente (vedi Materiali e attrezzature) per ottenere una migliore conduttività.
- Rimuovere la goccia di liquido dal foro con tampone di piccole dimensioni (vedi Materiali e attrezzature) e immergere l'ago di vetro al foro secondo le coordinate del sito di iniezione.
- Infondere 25-100 nl della soluzione iniettabile al tasso da 5 a 20 nl / sec.
- Rimuovere rapidamente la pipetta e electroporate immediatamente. Elettroporazione viene effettuata mediante l'applicazione di cinque impulsi rettangolo con la durata di 50 ms e l'ampiezza di 99 V alla frequenza di 1 Hz.
- Rimuovere gli elettrodi e bar orecchio.
- Cucire la pelle tagliata usando una combinazione di una pinza muto (vedi Materiali e attrezzature) e taglienti e fili chirurgici (vedi Materiali e attrezzature).
- Collocare il cucciolo nella camera calda per 15-30 minuti per aiutare il suo recupero dopo l'anestesia.
- Poi mettere il cucciolo torna alla gabbia della madre.
7. Rappresentante Risultati
L'espressione del transgene nelle cellule transfettate con successo apparirà circa 10 ore dopo l'elettroporazione, e rimarrà stabile per diverse settimane.
Noi microiniettati il plasmide sia in profondità strati corticali o regione striato del giorno post-natale 2 (P2) e cuccioli di ratto Wistar eseguita in elettroporazione in vivo come descritto sopra. Sezioni di cervello (400 micron di spessore) sono stati tagliati dopo 2 a 6 giorni (P4-P8) usando un vibrotome a freddo affettare a pezzi medi (Hepes tamponata soluzione equilibrata Salt Earle) 10. Acquisizione delle immagini è stata effettuata utilizzando Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal microscopio confocale (Zeiss, Germania) nel medio taglio a temperatura ambiente.
I siti di iniezione in profondità strati corticali e nello striato contenute molte cellule transfettate che esprimono EGFP che si trovavano in una regione compatta di circa 200-300 micron di diametro (Figura 1A, B). All'interno delle cellule transfettate, il livello di espressione EGFP è sufficientemente elevato per consentire l'imaging di sottili processi cellulari (Figura 1C) tra cui dendriti con spine di forme diverse (Figura 1D) e fasci di assoni (Fig. 1E). La stabilità robusta di EGFP così come la vitalità cellulare dopo l'elettroporazione permesso tracciamento parti distali degli assoni (fino a 1,5-2 mm dal corpo cellulare), come terminali corticali (Figura 1F).
Figura 1. (A) transfettate con successo le cellule nella regione striato di cervello di ratto P4 delineare il plasmide sito di iniezione. (B), le cellule transfettati in profondità strati corticali (circa 1000 micron sotto la superficie corticale) di cervello di ratto P5. (C) Una cellula trasfettate nella regione striato di ratto cervello P8. (D) i processi di una cellula dendritiche transfettate nella regione striato di ratto cervello P8; frecce indicano i diversi tipi di spine dendritiche e filopodia. (E) Gli assoni delle cellule transfettate in via collaterale. (F) Gli assoni che terminano presso l'superficie piale di P8 ratto corteccia (punta di freccia). Barre di scala sono 100 micron su A, B, E e F; 10 micron su C e D.
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Discussion
Metodi di consegna del gene nel cervello dei roditori viventi sono ben stabiliti per elettroporazione in utero 7,8,11,12 e, più recentemente, per l'elettroporazione postnatale 6. Tuttavia, questi metodi si basano su iniezione intraventricolare del DNA plasmide, che può essere limitante per diverse applicazioni. Per esempio, questi metodi non consentono targeting cellule in alcune aree cerebrali quali l'ippocampo, né la transfezione di questi non-migratori tipi di cellule come astrociti corticali. Non-ventricolare iniezione accoppiato con elettroporazione è stato impiegato per la consegna del gene nei neuroni del cervelletto 13. Il nostro protocollo illustra l'estensione della non-ventricolare metodo per altre regioni del cervello di ratto. Proponiamo che il nostro approccio metodologico è una valida alternativa ai metodi di consegna del gene virale alle aree riservate di interesse all'interno del cervello di ratto post-natale 5.
Nonostante i vantaggi del metodo attuale, alcune difficoltà ci si può aspettare come descritto di seguito.
Età 1.Optimal di animali
Quando possibile, più giovane cuccioli di ratto neonato dovrebbe essere utilizzato, come mezzo per incrementare sia l'efficacia di trasfezione e della sopravvivenza dei cuccioli dopo l'intervento chirurgico. Nelle nostre mani, il P0 cuccioli sono troppo piccoli in quanto è difficile obiettivo riproducibile una certa area del cervello utilizzando stereotassica coordinate ottenute dal cervello atlante disponibili per questo all'età di 14 anni. Inoltre, il P0 cuccioli hanno la pelle sottile e tenera che possono impedire cucire. Il P3 e P4 sono più conveniente in termini di manipolazioni chirurgiche e stereotassica, rispetto a P0-P2 animali, ma hanno ipersensibilità al anestesia isoflurano che possono causare convulsioni e interruzioni di respirazione durante l'intervento. Così, la migliore opzione è P1-P2 cuccioli di ratto, che sono prevedibili durante l'intervento chirurgico e abbastanza grande per microiniezioni riproducibile.
Problemi 2.Possible con microiniezione
Quando piccoli volumi di soluzione (25-100 nl) sono iniettati attraverso punta di vetro sottile al tessuto cerebrale esercita una pressione avversaria, è fondamentale che le bolle d'aria o perdite sono accuratamente evitati. Il mancato rispetto di questi può causare una diminuzione drammatica in termini di efficienza di trasfezione.
3.Precision limiti per le coordinate stereotassiche
Nonostante la precisione delle coordinate stereotassiche, hanno un limite a 0,3 riproducibilità mm 15. Nella nostra esperienza l'uso di animali della stessa età e il peso è possibile ridurre questo limite di 0,2-0,1 mm che è sufficiente per il targeting riproducibile dell'area CA1 dell'ippocampo.
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Acknowledgments
Ringraziamo Ekaterina Karelina per un aiuto con la registrazione colonna sonora per il video, Ivan Molotkov di animazione 3D e il Dr. Peter Blaesse per CAG-EGFP preparazione plasmide.
Il lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del Centro di Mobilità Internazionale della Finlandia, il finlandese della Fondazione Culturale e l'Accademia di Finlandia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | Fine Science Tools | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing micr–lectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting Co. | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–lting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting Co. | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | Fine Science Tools | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
References
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
- Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
- Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
- Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
- Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. , 3rd edition, Academic Press. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 6th edition, Academic Press. (2007).
