Summary
Detta protokoll beskriver en icke-virala metoden för leverans av genetiska konstruktioner till ett visst område av levande gnagare hjärnan. Metoden består av plasmid förberedelser, mikropipett tillverkning, neonatal hos råttungar kirurgi, mikroinjektion av konstruktionen, och
Abstract
Skapande av transgena djur är en vanlig metod för att studera funktioner av en gen av intresse in vivo. Men många knockout eller transgena djur inte är livskraftiga i de fall där den modifierade genen uttrycks eller tas bort i hela organismen. Dessutom en rad kompensatoriska mekanismer gör det ofta svårt att tolka resultaten. Den kompensatoriska effekter kan lindras genom att antingen tajma genuttryck eller begränsa mängden transfekterade cellerna.
Metoden för postnatal icke-ventrikulära mikroinjektion och in vivo elektroporering gör målstyrning av gener, siRNA eller färg molekyler direkt till en liten region av intresse hos nyfödda gnagare hjärnan. I motsats till konventionella ventrikulär injektionsteknik, kan denna metod transfektion av icke-flyttande celltyper. Djur transfekterade med hjälp av den metod som beskrivs här kan användas till exempel för två-photon in vivo imaging eller elektrofysiologiska experiment på akut hjärnan skivor.
Protocol
1. Inledning
Skapande av transgena djur är en kraftfull metod för undersökning av genfunktioner i levande djur 1 och för att reda ut sjukdomsmekanismen 2,3 samt för att manipulera egenskaper hos celler 4. Däremot är förfarandet ganska mödosamt, mycket tidskrävande och dyrt, vilket motiverar användning av alternativa metoder Gene Delivery såsom virus injektion 5, neonatal ventrikulär injektion med elektroporation 6 och i livmodern elektroporation 7,8. Metoden för postnatal icke-ventrikulär injektion och elektroporation har en unik uppsättning av fördelar: användning av icke-virala genetiska konstruktioner, möjligheten att skapa en lokal uttryck mönster i det intressanta området, in situ transfektion av icke-flyttande celltyper, t.ex. kortikala astrocyter.
I denna video visar vi den detaljerade förfarandet för postnatal gen leverans till nyfödda råttor hjärnan med en plasmid som kodar för det förstärkta grönt fluorescerande protein i kyckling beta aktin promotor med CMV förstärkare (pCAG-EGFP) 9. Vi illustrerar utarbetandet av plasmiden innehåller injektionslösning, tillverkning av tunt glas pipetter och montering av microinjector på en stereotaktisk instrument. Då vi talar om anaesthetizing råttungar med isofluran, om hur du utför operationen, om injektionen förfarandet och om elektroporation Använd pincett elektroder och in vivo porator. Slutligen diskuterar vi kortfattat de förväntade resultaten, perspektiv och svårigheter som kan uppstå under dessa experiment.
2. Plasmid Förberedelse för elektroporation
- Vi förbereder vanligtvis 10 ìl av plasmiden injektionslösning i en 200 l tunn vägg rör. Denna lösning är tillräcklig för flera experiment.
- Vi blandar 8 ìl av plasmiden lösningen (se Material och utrustning) med 1 ìl av 10X PBS (se Material och utrustning) och 1 l på 0,1% Snabb Grönt vatten lösning (se Material och utrustning).
- Den slutliga koncentrationen av plasmiden i injektionslösningen bör vara mellan 1 och 3 mikrogram / l. Lägre koncentrationer av plasmid-DNA kommer att minska transfektion effektivitet, medan den högre DNA-koncentrationen blir för trögflytande för injektion genom den tunna toppen av glaset kapillär.
3. Glasnål Förberedelser
- För glaspipett beredning använder vi borosilikatglas kapillär med en glödtråd (se Material och utrustning) och en vertikal elektrod glas avdragare (se Material och utrustning) på maximalt dra och värme parametrar.
- Vi bryter då spetsen på pipetten med hjälp av ett papper för att uppnå ett tips 10-20 mikrometer i diameter.
- Vi kontrollerar spetsen diameter och form under mikroskop målet.
4. Microinjector Montering
- Med hjälp av en tunn polymer kapillär (se Material och utrustning) vi fyller ca 1 / 3 av volymen av en 10 l Hamilton sprutan (se Material och utrustning) med mineralolja (se Material och utrustning). Undvik luftbubblor!
- Då kan vi fylla glaspipett med mineralolja och sätt pipetten i Hamilton sprutan. Undvik luftbubblor!
- Sprutan med glaspipett är sedan fast på microinjector ansluten till en regulator (se Material och utrustning).
- Det mikroinjektion inställning fast på en stereotaktisk instrument (se Material och utrustning) ger oss möjlighet att säkert doppa toppen av glaspipett i röret med hjälp av plasmiden injektionslösning.
- När spetsen vidrör ytan av lösningen, doppa den ytterligare med 1 eller 2 mm och fylla pipetten med ca 1 l av injektionen blanda med mikro injektorn controller.
5. Anaesthetizing djur
Alla förfaranden som presenteras här har utförts enligt Helsingfors universitets regler för djurförsök.
- För varje experiment fyller vi en gastät spruta (se Material och utrustning) med ca 2 ml isofluran (se Material och utrustning).
- Än sprutan är fast på anestesi enheten (se Material och utrustning) är ansluten till luftflödet källa djuret rutan och masken fast på stereotaktisk setup.
- På anestesi enheten, justera vi luftflödet till cirka 250 ml / min och isofluran nivå till 4%.
- Vi lägger hos råttungar in djuret rutan för 2-5 minuter.
- När valpen slutar röra, placera den på värmedyna (se Material och utrustning) fäst vid stereotaktisk installationen.
- Placera en rostralt del av valpens huvud i anaesthetizing masken.
- Det tar 5 till 10 minuter förvalpen att komma in i djup narkos.
- Kontrollera anestesi DJUP med en svans nypa och minska isofluran inflödet till ca 1,5 till 2,0%.
6. Kirurgi, mikroinjektion och elektroporation
- Behandla huden på valpens huvud med 70% etanol.
- Använda en liten sax (se Material och utrustning) och tunn pincett (se Material och utrustning), skära in i huden från en nackskinnet på valpen till sin panna.
- Böj hud bitar i sidled och dra örat barer något i ljudform mynningen på skallen för huvud och hud fixering.
- Med hjälp av en kikare mikroskop, letar vi bregma punkt på skallen.
- Identifiera regionen av intresse att använda stereotaktisk koordinater.
- Placera injektionen pipetten ovanför det här området och markera det genom att släppa 25-50 NL av injektionslösningen på skallen ytan.
- Borra skallen sakta och försiktigt vid den markerade punkten med en hög hastighet kirurgisk borr (se Material och utrustning) under mikroskop tills vätskan visas i borrade området.
- Fixa en electropotation pincett elektroder (se Material och utrustning) på sidorna av skallen med nuvarande ledande gel (se Material och utrustning) för att uppnå bättre ledningsförmåga.
- Avlägsna vätskan droppa från det borrade hålet med en liten tampong (se Material och utrustning) och doppa glaset nålen i hålet enligt koordinaterna för injektionsstället.
- Ingjuta 25 till 100 nl i injektionslösningen i den takt 5 till 20 nl / sek.
- Snabbt bort pipetten och electroporate omedelbart. Elektroporation sker med hjälp av fem rektangel pulser med varaktigheten av 50 ms och amplitud 99 V på frekvens av 1 Hz.
- Ta bort elektroderna och barer öra.
- Sy skära huden med en kombination av en dum (se Material och utrustning) och vassa pincett och kirurgisk ämnen (se Material och utrustning).
- Placera valpen i den varma kammaren i 15-30 minuter för att hjälpa sin återhämtning efter anestesi.
- Lägg sedan valpen tillbaka till sin moders bur.
7. Representativa resultat
Uttrycket av transgenen i framgångsrikt transfekterade cellerna visas cirka 10 timmar efter elektroporation, och det kommer att förbli stabila i flera veckor.
Vi idag injiceras plasmiden antingen i djup kortikala lager eller striatum region postnatal dag 2 (P2) Wistar råttungar och utfört in vivo elektroporering enligt ovan. Hjärnan skivor (400 mikrometer i tjocklek) kapades efter 2 till 6 dagar (P4-P8) med en vibrotome i kallt skivning medium (Hepes buffrad Earles Balanced Salt Solution) 10. Bild Förvärvet genomfördes med Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal konfokalmikroskop (Zeiss, Tyskland) i skivning mediet vid rumstemperatur.
Injektionsställe i djup kortikala lager och striatum innehöll många transfekterade celler som uttrycker EGFP som var belägen i ett kompakt område på cirka 200-300 nm i diameter (Figur 1A, B). Inom transfekterade celler är EGFP uttrycket tillräckligt hög nivå för att möjliggöra avbildning av tunna cellulära processer (Figur 1C) inklusive dendriter med ryggar i olika former (figur 1D) och buntar axonet (figur 1E). Den robusta stabilitet EGFP samt cellviabiliteten efter elektroporation tillåtet att spåra distala delar av axoner (upp till 1,5-2 mm från cell organ) som kortikal terminaler (Figur 1F).
Figur 1. (A) Klara transfekterade celler i striatum regionen P4 råtthjärna avgränsar plasmiden injektionsstället. (B) transfekterade celler i djup kortikala skikt (ca 1000 ìm nedan kortikala ytan) för P5 råtta hjärnan. (C) En transfekterade celler i striatum regionen P8 råtta hjärnan. (D) Dendritiska processer av en transfekterade celler i striatum regionen P8 råtta hjärnan, pilarna visar olika typer av Dendritutskotten och filopodia. (E) Axoner av transfekterade celler inom säkerhet väg. (F) Axoner avslutas vid samma pial yta P8 råtta cortex (pilspets). Skala barer är 100 ìm på A, B, E och F, 10 mikrometer på C och D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder för genterapi leverans till levande gnagare hjärnan är väl etablerade i livmodern elektroporering 7,8,11,12 och, mer nyligen, för efter födsel elektroporation 6. Men dessa metoder som bygger på intraventrikulära injektion av plasmid-DNA, som kan vara begränsande för flera tillämpningar. Till exempel tillåter dessa metoder inte är inriktade på celler i vissa områden i hjärnan som hippocampus, och inte heller transfektion av sådana icke-flyttande celltyper som kortikal astrocyter. Icke-ventrikulär injektion i kombination med elektroporering användes först för gen leverans till lillhjärnan nervceller 13. Vår protokoll illustrerar utvidgning av icke-ventrikulära metod för andra regioner i råtta hjärnan. Vi föreslår att vår metod är ett användbart alternativ till viral metoder för gen leverans till begränsade områden av intresse inom postnatal råtta hjärnan 5.
Trots fördelarna med den nuvarande metoden, kan vissa svårigheter förväntas som diskuteras nedan.
1.Optimal ålder av animaliskt
Om möjligt bör yngre neonatal råttungar kan använda, som ett sätt att öka både transfektion effekt och överlevnad efter operation. I våra händer, P0 ungarna är för små eftersom det är svårt att rikta reproducerbart ett visst område i hjärnan med hjälp av stereotaktisk koordinater från hjärnan atlas för den här 14 års ålder. Dessutom P0 valparna har tunna och ömma hud som kan hindra sömnad. P3 och P4 är mest praktiskt i form av kirurgisk och stereotaktisk manipulationer jämfört med P0-P2 djur, men de har överkänslighet mot isoflurananestesi som kan orsaka kramper och avbrott andning under operation. Därför är det bästa alternativet P1-P2 råttungar som är förutsägbar under operation och tillräckligt stor för reproducerbara microinjections.
2.Possible problem med mikroinjektion
När små volymer av lösning (25-100 nl) injiceras genom tunna glas tips till hjärnvävnaden utövar ett motstående tryck, är det viktigt att luftbubblor eller läckage noggrant undviks. Underlåtenhet att undvika dessa kan orsaka en dramatisk minskning av transfektion effektivitet.
3.Precision gränser för stereotaktisk koordinater
Trots den precision stereotaktisk koordinater, de har en gräns vid 0,3 mm reproducerbarhet 15. I vår erfarenhet av att använda djur i samma ålder och vikt är det möjligt att sänka denna gräns till 0,2-0,1 mm vilket är tillräckligt för reproducerbara inriktning av CA1 hippocampus-området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Ekaterina Karelina för hjälp med soundtrack inspelning för video, Ivan Molotkov för 3D-animering och Dr Peter Blaesse för CAG-EGFP plasmid beredning.
Arbetet har finansierats med bidrag från Centrum för internationellt personutbyte i Finland, Finska kulturfonden och Finlands Akademi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | Fine Science Tools | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing micr–lectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting Co. | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–lting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting Co. | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | Fine Science Tools | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
References
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
- Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
- Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
- Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
- Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. , 3rd edition, Academic Press. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 6th edition, Academic Press. (2007).
