التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

Summary

هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من أجنة ذبابة الفاكهة midgastrula المرحلة. آراء الثقافات الحية تظهر الخلايا 1 بعد ساعة من الطلاء ، والخلايا العصبية متباينة بعد 2 أيام من النمو في وسط بيكربونات المستندة إلى المعرفة. والخلايا العصبية كهربائيا منفعل وشكل اتصالات متشابك.

Abstract

هذا الفيديو يوضح الإجراء لصنع الثقافات العصبية الأولية من أجنة ذبابة الفاكهة midgastrula المرحلة. وأظهرت وسائل لجمع الأجنة وdechorionation وذلك باستخدام مواد التبييض. باستخدام الماصة الزجاج تعلق على الفم أنبوب الشفط ، نحن لتوضيح وإزالة جميع الخلايا من الأجنة واحد. ويتضح من طريقة لتفريق الخلايا من كل embyro إلى انخفاض عدد (5 لتر) متوسطة صغيرة من الزجاج على ساترة غير المصقول. وجهة نظر من خلال المجهر في 1 ساعة بعد الطلاء يوضح كثافة الخلية المفضل. معظم الخلايا التي تزرع في البقاء على قيد الحياة عندما يتم تعريف المتوسطة neuroblasts التي تقسم مرة أو أكثر في الثقافة قبل توسيع العمليات لالتهاب الأعصاب من قبل 12-24 ساعة. وجهة نظر من خلال المجهر يوضح مستوى ثمرة neurite والمتفرعة من المتوقع في ظل ثقافة صحية في 2 أيام في المختبر. تزرع الثقافات في بيكربونات البسيط القائم المتوسطة محددة ، في حاضنة CO ₂ 5 ٪ إلى 22-24 درجة مئوية. عمليات التهاب الأعصاب مواصلة تطويرها على مدى الأسبوع الأول في الثقافة وعندما اجراء اتصالات مع neurites من الخلايا المجاورة التي غالبا ما تشكل اتصالات متشابك وظيفية. الخلايا العصبية في التعبير عن هذه الثقافات الجهد بوابات الصوديوم والكالسيوم والبوتاسيوم ، وقنوات ومنفعل كهربائيا. ثقافة هذا النظام مفيد لدراسة العوامل الوراثية الجزيئية والبيئية التي تنظم تمايز الخلايا العصبية ، استثارة ، وتشكيل المشبك / وظيفة.

Protocol

أولا جمع الأجنة ذبابة الفاكهة

1. إعداد لوحات جمع البيض
   1. يغلي 200 مل درهم ₂ O مع آغار ز 8
   2. تبرد إلى 50 درجة مئوية
   3. إضافة 2 مل EtOH و2 مل حمض الخليك
   4. 35 ملم تصب في أطباق بتري بلاستيكية ، قمم
   5. باردة وتخزينها في حاوية الهواء ضيق عند 4 درجة مئوية
   6. يجعل ما يقرب من 80 لوحات
2. إعداد عجينة الخميرة
   1. تذوب الخميرة Fleishmans الخبز الناشطة في الماء لتكوين عجينة
   2. الميكروويف لمدة 20-30 ثانية لتقتل الخميرة (احترس من الغليان فوق)
   3. متجر في 10 حقنة سم (بدون الإبرة) في 4 أسابيع 2 درجة مئوية لمدة
3. الذباب : الكبار استخدامها لجمع البيض عموما الأكثر إنتاجية بين 3 و 14 يوما بعد الناشئة ، وتوفير انهم تمكنوا من الوصول إلى المواد الغذائية الطازجة. وانخفضت مخزونات متحولة العديد من الخصوبة التي يمكن أن يعبر عن نفسه في خفض معدل لوضع البيض وإحداث تغيير في السن التي هي الأكثر إنتاجا. عموما ، عدة مئات من البالغين لجعل السكان البيض الذي وضع جيد.
4. الإجراء : انتشار طبقة رقيقة من خميرة العجينة على لوحة جمع بيضة. وهذا يوفر ركيزة مواتية لوضع البيض. الكبار نقل الذباب لجمع البيض زجاجة نظيفة وشريط لوحة جمع إلى فم الزجاجة. لا تترك الذباب في هذه الزجاجات وقتا أطول من 3-4 ساعات كما ترتفع نسبة الرطوبة واجهتك مشكلة الذباب في لصق وعلى جانبي الزجاجة.

II. Dechorionation الجنين مع بليتش

1. انشاء قمع بوخنر متصلة قارورة مرشح لتولي الشافطة. وضع قطعة من الورق Whatman 1 # في القمع. مع السحب على التوالي ، ورقة مبللة بالماء المقطر العقيمة.
2. شطف أجنة من جمع لوحات على ورقة الترشيح مع تيار من الماء من زجاجة الغسيل.
3. شطف لهم في عدة مجلدات من الماء المعقم ، إيقاف الشافطة ، ثم إضافة حجم القمع من المبيض بنسبة 50 ٪. دعونا نجلس البيض 5-10 دقائق. وسيتم حل chorions في 1-2 دقائق ، ولكن يعد لكم ترك الأجنة في التبييض سيتم تدمير أكثر من خميرة تلوث. اقتطاف البالغين أو أي اليرقات التي مشطوف قبالة الطبق.
4. شطف الأجنة في طبق بتري معقمة (NOT زراعة الأنسجة) مع الماء المقطر العقيمة. والعديد من الأجنة عصا إلى أسفل الطبق إذا لم يكن قبل المبللة. الشطف عدة مرات مع الماء المعقم في هذا الطبق.
5. فحص الأجنة التي تنتقل مع الضوء على اقتطاف الأجنة مرحلة منتصف المعيدة.

III. إعداد الثقافات جنين واحد

1. جعل DDM1 (انظر صفات في الفرع الرابع)
2. صب الماء قبالة طبق من الأجنة فقط قبل زراعة. الأجنة مع وسائل الاعلام تغطية عقيمة.
3. المبينة 3 ، 35 مم أطباق بتري. وضعت في الجولة 4 coverslips تعقيمها في كل طبق. على كل ساترة ، وطرح 5 ميكرولتر من المتوسط. استخدام الزجاج Bellco يؤدي coverslips coverlips المنخفضة.
   
   Bellco البيولوجي زجاجيات
   800-257-7043
   القط # 1943-00012
   
   
4. سحب بعض pipets الغرامة إلى حد ما. وسحبت pipets نستخدمها على مجتذب PP - 83 Narishige. أبعاد الدقيق للالماصة ليست حاسمة ، ونحن عادة سحب لهم أدق مما كنا نريد منهم وقطع رأس في نفس المجال للرأي والجنين لقياس الحجم. كنت لا تريد أن تمتص كل من الأجنة في آن واحد ، والخاص لا نريد قمة صغيرة جدا لدرجة ان الامر يستغرق 5 دقائق لامتصاص الخلايا. تهدف لفي مكان ما بين. فحص الأجنة التي تنتقل مع الضوء واستخدام انبوب شفط الفم تعلق على الماصة لإزالة محتويات الجنين. تفريق الخلايا على استعداد لساترة بطرد الخلايا برفق أقرب إلى ساترة ممكن. قد ترغب في النظر في coverslips في أعلى السلطة ، وكذلك تفريق الخلايا في نفس الطريقة.
5. السماح للخلايا الجلوس لمدة لا تزيد عن 10 دقائق. الفيضانات الطبق مع وسائل الاعلام وضعت في الحاضنة ، 4-5 ٪ CO ₂ البيئة ، إذا به المتوسطة محددة. درجات الحرارة بين 22-24 درجة مئوية. نستخدم عادة 23 درجة مئوية والرطوبة 95 ٪. الرطوبة هو المهم ، كما كنت تريد تجنب التبخر. يمكنك استخدام معيار حاضنة الثدييات وضعت في coldroom مع مجموعة التحكم في درجة الحرارة إلى 23 درجة مئوية.

رابعا. DDM1 المتوسطة محدد لنمو الثقافات

1. جعل DMEM : إلى 100 مليليتر من وسائل الإعلام في F12/DME هام (DMEM) (ايرفين العلمية # 9052).
   1. إضافة Hepes 0،476 ز (20mM) (سيغما # H - 3375). المزيج.
   2. إضافة 1.25 مل الجلوتامين L - 200 ملم (ايرفين العلمية # 9317). المزيج.
   3. تصفية في غطاء محرك السيارة مع 0.2 ميكرومتر خلات تصفية حقنة (الحاجة 2 مرشحات).
   4. 6،64 درجة الحموضة وOSM 288.
   5. جعل من aliquots 10ML في أنابيب الطرد المركزي 15ml.
   6. مخزن عند 4 درجة مئوية لمدة أسابيع لا أكثر من 2.
      
      ملاحظة : استخدم دائما تعقيمها الماء المصفى واجري في الحاويات التي محجوزة للإعلام والمكملات فقط. لم يضع القطب درجة الحموضة أو تحريك شريط تستخدم لأغراض أخرى في Media.To جعل DDM1 : إضافة ملاحق المذكورة أدناهلDMEM قبيل زراعة.
      
      
2. الى 10 مليليتر من إضافة DMEM :
   • 100 ميكرولتر ترانسفيرين
   • 100 بوتريسين ميكرولتر
   • 100 السيلينيوم ميكرولتر
   • 100 البروجسترون ميكرولتر
   • 50 ميكرولتر الأنسولين

Discussion

في الثقافات ذبابة الفاكهة المحضرة من الأجنة مرحلة midgastrula الخلايا العصبية تنشأ من neuroblast السلائف ، وكثير منها الفجوة قبل التمايز في المختبر. هذا النظام يوفر بالتالي فرصة فريدة لاستكشاف عوامل وراثية وبيئية مهمة في مراحل مبكرة جدا من تطور الخلايا العصبية (Rohrbaugh وآخرون ، 2003). لقد أظهرنا أن الخلايا العصبية نمت في المتوسط ​​بسيطة محددة تفرق في الخلايا العصبية التي تشكل كهربائيا منفعل أيضا اتصالات متشابك وظيفية (يا داود ، 1995 ؛ لي ودود يا ، 1999). باستخدام التحليل من المسوخ و / أو التلاعب الدوائية ، في تركيبة مع المعايير كلها تقنيات التسجيل الخلية ويمكن استخدام هذا النظام النموذجي لاستكشاف دور الجينات والعوامل البيئية العاملة في مجال التنمية من استثارة الكهربائية ونقلها متشابك (هودجز وآخرون ، 2002 ؛. لي يا ودود ، 2000 ؛ لي وآخرون ، 2003).

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.