Summary
इस वीडियो midgastrula चरण ड्रोसोफिला के भ्रूण से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों की तैयारी को दर्शाता है. जीना संस्कृतियों के दृश्य और एक बिकारबोनिट आधारित परिभाषित मध्यम में विकास के 2 दिनों के बाद चढ़ाना विभेदित न्यूरॉन्स के बाद कोशिकाओं 1 घंटे दिखाते हैं. न्यूरॉन्स विद्युत उत्तेजनीय हैं और synaptic कनेक्शन के रूप में.
Abstract
इस वीडियो midgastrula चरण ड्रोसोफिला भ्रूण से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों बनाने के लिए प्रक्रिया दिखाता है. भ्रूण और उनके dechorionation ब्लीच का उपयोग कर इकट्ठा करने के लिए तरीकों का प्रदर्शन कर रहे हैं. एक गिलास एक मुँह चूषण ट्यूब से जुड़ी pipet का उपयोग करना, हम एक भ्रूण से सभी कक्षों को हटाने के वर्णन. एक uncoated कांच coverslip पर एक छोटे से मध्यम (मैं 5) के ड्रॉप में प्रत्येक embyro से कोशिकाओं dispersing के लिए विधि का प्रदर्शन है. माइक्रोस्कोप के माध्यम से चढ़ाना के बाद एक घंटे में एक दृश्य पसंदीदा सेल घनत्व दिखाता है. कोशिकाओं है कि जीवित जब परिभाषित माध्यम से हो के अधिकांश neuroblasts है कि 12-24 घंटे के द्वारा neuritic प्रक्रियाओं के विस्तार से पहले संस्कृति में एक या एक से अधिक बार विभाजित कर रहे हैं. माइक्रोस्कोप के माध्यम से एक दृश्य neurite परिणाम के स्तर को दिखाता है और इन विट्रो में 2 दिन में एक स्वस्थ संस्कृति में उम्मीद की शाखाओं में बंटी है. संस्कृतियों को एक सरल परिभाषित मध्यम आधारित बिकारबोनिट में बड़े हो रहे हैं, 22-24 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में Neuritic प्रक्रियाओं पर पहले हफ्ते विस्तृत संस्कृति में जारी है और जब वे पड़ोसी कोशिकाओं वे अक्सर कार्यात्मक synaptic कनेक्शन फार्म से neurites के साथ संपर्क बनाने. इन संस्कृतियों में न्यूरॉन्स वोल्टेज gated सोडियम, कैल्शियम और पोटेशियम चैनलों एक्सप्रेस और विद्युत उत्तेजनीय हैं. यह संस्कृति प्रणाली आणविक आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि neuronal भेदभाव, excitability, और synapse गठन / समारोह को विनियमित अध्ययन के लिए उपयोगी है.
Protocol
मैं ड्रोसोफिला भ्रूण संग्रह
- अंडे संग्रह प्लेटों की तैयारी
- उबाल लें 200 मिलीलीटर 8 जी अगर साथ DH 2 हे
- 50 से अच्छा डिग्री सेल्सियस
- 2 मिलीलीटर EtOH और 2 मिलीलीटर एसिटिक एसिड जोड़ें
- 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश, सबसे ऊपर में डालो
- कूल और 4 में हवा तंग कंटेनर में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- लगभग 80 प्लेटें बनाता है
- खमीर पेस्ट तैयार करें
- पानी में Fleishmans सक्रिय पकाना खमीर भंग पेस्ट करने के लिए फार्म
- 20-30 के लिए खमीर को मारने सेकंड के लिए माइक्रोवेव (पर उबलते के लिए बाहर देखो)
- 4 ° के लिए सी 2 सप्ताह में 10 सीसी सिरिंज (सुई के बिना) में स्टोर
- मक्खियों: अंडे संग्रह के लिए इस्तेमाल किया वयस्कों आम तौर पर कर रहे हैं सबसे अधिक उत्पादक और 3 के बीच 14 दिनों के उभरते के बाद, कि वे ताजा भोजन करने के लिए उपयोग किया था प्रदान. कई उत्परिवर्ती शेयरों उर्वरता कि खुद अंडे बिछाने और उम्र में वे सबसे अधिक उत्पादक हैं में एक परिवर्तन की एक कम दर में प्रकट कर सकते हैं कमी आई है. आम तौर पर, कई सौ वयस्कों एक अच्छा आबादी अंडे बिछाने के लिए बनाते हैं.
- प्रक्रिया: एक अंडा संग्रह थाली पर पेस्ट खमीर की एक पतली परत बिखरा हुआ है. यह अंडे की बिछाने के लिए एक अनुकूल सब्सट्रेट प्रदान करता है. स्थानांतरण वयस्क एक साफ अंडे संग्रह बोतल और संग्रह थाली टेप करने के लिए बोतल के मुंह में मक्खियों. इन अब 3-4 घंटे से बोतलों में मक्खियों को छोड़ के रूप में नमी उगता है और मक्खियों पेस्ट और बोतल के पक्षों पर अटक जाते हैं मत करो.
द्वितीय. ब्लीच के साथ भ्रूण Dechorionation
- एक Buchner कीप एक फिल्टर एक Aspirator संलग्न कुप्पी से जुड़े सेट. कीप में वाटमान # 1 कागज का एक टुकड़ा रखो. चूषण चलाने के साथ, बाँझ आसुत जल के साथ कागज गीला.
- एक धोने की बोतल से पानी की एक धारा के साथ फिल्टर पेपर पर संग्रह प्लेटों से भ्रूण कुल्ला.
- उन्हें बाँझ पानी के कई खंडों में कुल्ला बंद Aspirator बारी है, और फिर 50% ब्लीच का एक कीप मात्रा जोड़ने. अंडे 5-10 मिनट बैठो. chorions 1-2 मिनट में भंग हो जाएगा, लेकिन अब तुम ब्लीच में भ्रूण छोड़ contaminating खमीर नष्ट हो जाएगा. बाहर किसी भी वयस्कों या लार्वा कि बंद पकवान rinsed है उठाओ.
- बाँझ आसुत पानी के साथ एक बाँझ पेट्री डिश (नहीं टिशू कल्चर) में भ्रूण कुल्ला. भ्रूण के कई पकवान के नीचे करने के लिए छड़ी अगर यह पूर्व गीला नहीं किया गया है. इस डिश में बाँझ पानी के साथ कई बार कुल्ला.
- प्रेषित प्रकाश के साथ भ्रूण की जांच करने के लिए मध्य गेसट्रुला चरण भ्रूण लेने.
III. एकल भ्रूण संस्कृतियों की तैयारी
- DDM1 (अनुभाग चतुर्थ में व्यंजनों देखें)
- भ्रूण के पकवान बंद संवर्धन करने के लिए पहले पानी डालो. बाँझ मीडिया के साथ भ्रूण कवर.
- 3, 35 मिमी पेट्री डिश बाहर सेट. हर डिश में 4 autoclaved दौर coverslips में रखो. प्रत्येक coverslip पर, मध्यम के 5 μl डाल दिया. Bellco coverslips कम नेतृत्व कांच coverlips का उपयोग करें.
Bellco जैविक कांच के बने पदार्थ
800-257-7043
1943-00012 # बिल्ली - कुछ काफी ठीक pipets खींचो. pipets का उपयोग हम Narishige खींचने पीपी-83 पर खींच रहे हैं. pipet की सटीक आयाम महत्वपूर्ण है और नहीं कर रहे हैं हम आम तौर पर उन्हें महीन से हम चाहते हैं खींच और उन्हें भ्रूण के रूप में देखने का एक ही क्षेत्र में टिप को तोड़ने के लिए आकार गेज. आप करने के लिए एक ही बार में भ्रूण के सभी चूसना नहीं चाहते हैं, करते हैं और अपने टिप इतना छोटा है कि यह 5 मिनट लगते हैं कोशिकाओं चूसना नहीं करना चाहती. बीच में कहीं के लिए निशाना लगाओ. प्रेषित प्रकाश के साथ भ्रूण की जांच करने और एक मुँह चूषण pipet से जुड़ी भ्रूण की सामग्री को हटाने के ट्यूब का उपयोग करें. धीरे कोशिकाओं को खदेड़ने के रूप में संभव के रूप में coverslip करने के लिए करीब से तैयार coverslip पर कोशिकाओं को फैलाने. आप उच्च शक्ति पर coverslips जांच करना चाहते हैं और आगे एक ही तरीके से कोशिकाओं को फैलाने सकता है.
- कोशिकाओं के लिए 10 मिनट से अधिक लंबी नहीं बैठते हैं. बाढ़ पकवान और मीडिया के साथ मशीन में डाल दिया, 4-5% सीओ 2 पर्यावरण, परिभाषित मध्यम का उपयोग कर यदि . 22-24 के बीच तापमान डिग्री सेल्सियस हम नियमित रूप से 23 डिग्री सेल्सियस और 95% आर्द्रता का उपयोग करें. आर्द्रता महत्वपूर्ण है, के रूप में आप के लिए वाष्पीकरण से बचने के लिए चाहते हैं. आप एक मानक स्तनधारी तापमान नियंत्रण के साथ एक coldroom में रखा इनक्यूबेटर 23 से सेट डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर सकते हैं
चतुर्थ. DDM1 संस्कृतियों बढ़ रही के लिए निर्धारित मध्यम
- के लिए 100 हाम F12/DME (DMEM) मीडिया (इरविन वैज्ञानिक # ९०५२) की mls: DMEM बनाएं
- .476 छ Hepes (20mm) (सिग्मा # एच - 3375) जोड़ें. मिक्स.
- 1.25 एल Glutamine मिलीलीटर 200 मिमी (इरविन वैज्ञानिक 9317 #) जोड़ें. मिक्स.
- 0.2 सुक्ष्ममापी एसीटेट सिरिंज फिल्टर (2 फिल्टर की जरूरत है) के साथ फ़िल्टर हुड में.
- पीएच 6.64 और 288 OSM है.
- 15ml अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 10ml के aliquots बनाओ.
- 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस से अधिक 2 सप्ताह के लिए.
नोट: हमेशा autoclaved फ़िल्टर्ड पानी का उपयोग करें और है कि मीडिया और पूरक के लिए ही आरक्षित हैं कंटेनर में. जोड़ें नीचे सूचीबद्ध की खुराक: डाल या कभी नहीं एक पीएच इलेक्ट्रोड Media.To में अन्य प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया बार हलचल DDM1 बनानेDMEM संवर्धन करने के लिए पहले.
- DMEM जोड़ने के 10 mls:
- 100 μl transferrin
- 100 μl Putrescine
- 100 μl सेलेनियम
- 100 μl प्रोजेस्टेरोन
- 50 μl इंसुलिन
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Discussion
ड्रोसोफिला midgastrula चरण भ्रूण से तैयार संस्कृतियों में न्यूरॉन्स neuroblast व्यापारियों, जिनमें से कई इन विट्रो में भेदभाव से पहले विभाजित से उत्पन्न होती हैं. यह प्रणाली इस प्रकार neuronal विकास के बहुत प्रारंभिक चरणों (Rohrbaugh एट अल., 2003) में आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों के अन्वेषण महत्वपूर्ण लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. हम पता चला है कि एक सरल माध्यम से परिभाषित हो न्यूरॉन्स विद्युत उत्तेजनीय न्यूरॉन्स भी है कि कार्यात्मक synaptic कनेक्शन के रूप में (हे Dowd, 1995, ली और हे Dowd, 1999) में अंतर है. म्यूटेंट और / या औषधीय जोड़तोड़ के विश्लेषण का प्रयोग, मानक पूरे सेल रिकॉर्डिंग तकनीक इस मॉडल प्रणाली भूमिका जीनों और पर्यावरणीय कारकों का पता लगाने के बिजली excitability और synaptic प्रसारण (होजेस एट अल, 2002 के विकास में शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ संयोजन में; ली. और हे Dowd, 2000; ली एट अल, 2003)..
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Acknowledgments
यह काम NIH अनुदान NS27501 के द्वारा DKOD समर्थित किया गया. एक HHMI प्रोफेसर अनुदान से DKOD इस काम के लिए अतिरिक्त समर्थन करते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
| Transferrin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
| Petri dishes | ||||
| Cover-slips | Bellco Glass | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
| Paper filter | Whatman, GE Healthcare | #1 | ||
| 10cc syringe | Tool | |||
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media. |
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References
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).
