Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

Summary

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. Vedute di colture vive visualizzare le celle 1 ora dopo la placcatura e neuroni differenziati dopo 2 giorni di crescita in un medium a base di bicarbonato definite. I neuroni sono elettricamente eccitabili e formare connessioni sinaptiche.

Abstract

Questo video illustra la procedura per le colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. I metodi per la raccolta di embrioni e la loro dechorionation con candeggina sono dimostrati. Utilizzando una pipetta di vetro collegata ad un tubo di aspirazione bocca, ci illustrano la rimozione di tutte le cellule da embrioni singolo. Il metodo per disperdere le cellule di ogni embyro in una piccola (5 l) goccia di media su un vetrino di vetro non rivestito è dimostrata. Una vista attraverso il microscopio a 1 ora dopo placcatura illustra la densità delle cellule preferito. La maggior parte delle cellule che sopravvivono quando coltivate in un terreno specifico sono neuroblasti che dividono una o più volte nella cultura prima di estendere i processi neuritiche da 12-24 ore. Una vista attraverso il microscopio illustra il livello di crescita dei neuriti e la ramificazione prevista una sana cultura a 2 giorni in vitro. Le culture sono cresciute in una semplice base di bicarbonato un terreno specifico, in un 5% di CO ₂ incubatore a 22-24 ° C. Processi neuritiche continuare a elaborare oltre la prima settimana di cultura e quando entrare in contatto con neuriti da cellule vicine spesso forma funzionale connessioni sinaptiche. I neuroni in queste culture, si manifestano voltaggio-dipendenti di sodio, calcio e canali del potassio e sono elettricamente eccitabili. Questo sistema di coltura è utile per lo studio molecolare dei fattori genetici e ambientali che regolano il differenziamento neuronale, eccitabilità, e formazione di sinapsi / funzione.

Protocol

I. Drosophila di raccolta degli embrioni

1. Preparare piatti raccolta delle uova
   1. Fate bollire 200 ml di dH ₂ O con 8 g di agar
   2. Raffreddare a 50 ° C
   3. Aggiungere 2 ml di EtOH e 2 ml di acido acetico
   4. Versare in 35 piatti di plastica millimetri Petri, top
   5. Raffreddare e conservare in un contenitore a tenuta d'aria a 4 ° C
   6. Fa circa 80 tavole
2. Preparare pasta lievito
   1. Sciogliere il lievito attivo Fleishmans cottura in acqua per pasta
   2. Microonde per 20-30 secondi per uccidere i lieviti (attenzione ai bollente)
   3. Conservare in siringa da 10 cc (senza ago) a 4 ° C per 2 settimane
3. Mosche: Gli adulti utilizzati per la raccolta delle uova sono generalmente più produttivi tra i 3 ei 14 giorni dopo emergenti, a condizione che essi hanno avuto accesso a cibi freschi. Molti stock mutante hanno ridotto la fertilità che può manifestarsi in un tasso ridotto di deposizione delle uova e un cambiamento l'età in cui sono più produttivi. In generale, diverse centinaia di adulti fanno per una buona deposizione delle uova della popolazione.
4. Procedimento: Stendere uno strato sottile di lievito pasta su una piastra di raccolta delle uova. Ciò fornisce un substrato favorevole per la posa delle uova. Adulti trasferimento vola una bottiglia pulita raccolta delle uova e nastro il piatto delle offerte alla bocca della bottiglia. Non lasciare le mosche in queste bottiglie più di 3-4 ore, come l'umidità aumenta e le mosche si blocca in pasta e sui lati della bottiglia.

II. Dechorionation embrione con candeggina

1. Impostare un imbuto Buchner collegato ad un pallone filtrante collegato ad un aspiratore. Mettete un pezzo di carta Whatman n. 1 nell'imbuto. Con aspirazione in funzione, bagnare la carta con acqua distillata sterile.
2. Sciacquare embrioni dalle piastre di raccolta sulla carta da filtro con un flusso di acqua da una bottiglia di lavaggio.
3. Sciacquare in diversi volumi di acqua sterile, spegnere aspiratore, e quindi aggiungere un volume imbuto del 50% di candeggina. Lasciate stare le uova 5-10 minuti. Il chorions sarà sciolto in 1-2 minuti, ma il più a lungo si lasciano gli embrioni in candeggina più del lievito contaminante verranno distrutti. Scegliere qualsiasi adulti o delle larve che hanno sciacquato piatto.
4. Sciacquare gli embrioni in una piastra di Petri sterile (NON coltura tissutale) con acqua distillata sterile. Molti degli embrioni che si attacchi al fondo del piatto se non è stato pre-bagnata. Sciacquare più volte con acqua sterile in questo piatto.
5. Esaminare gli embrioni a luce trasmessa di cogliere metà gastrula embrioni palco.

III. Preparazione delle colture singolo embrione

1. Fai DDM1 (vedi le ricette nella sezione IV)
2. Versare l'acqua al largo piatto di embrioni appena prima di coltura. Coprire gli embrioni con i media sterile.
3. Di cui 3, 35 mm piastre Petri. Mettere in 4 coprioggetto autoclave tondo in ogni piatto. Su ogni vetrino, mettere 5 ml di mezzo. Usa Bellco coprioggetto-bassa coverlips vetro al piombo.
   
   Bellco biologica Vetro
   800-257-7043
   Cat # 1943-00012
   
   
4. Tirare qualche pipette abbastanza bene. Le pipette da noi utilizzati sono tirato su un PP-83 estrattore Narishige. Le dimensioni esatte della pipetta non sono cruciali e noi di solito li tira più fine che vogliamo e li rompere la punta nello stesso campo di vista come l'embrione per misurare le dimensioni. Se non si desidera per aspirare tutti gli embrioni in una volta sola, e il vostro non vogliono la punta così piccolo che ci vogliono 5 minuti per aspirare le cellule. Puntare ad una via di mezzo. Esaminare gli embrioni a luce trasmessa e utilizzare un tubo di aspirazione collegato alla bocca la pipetta per rimuovere il contenuto dell 'embrione. Disperdere le cellule sul vetrino preparato con delicatezza espellere le cellule più vicino possibile al coprioggetto possibile. Si consiglia di esaminare i vetrini a più alto potere e disperdere ulteriormente le cellule nello stesso modo.
5. Lasciate che le cellule sedersi per non più di 10 minuti. Inondare il piatto con i media e messo in incubatrice, 4-5% CO ₂ ambiente, se si utilizza un terreno specifico. Temperatura tra 22-24 ° C. Noi abitualmente uso 23 ° C e 95% di umidità. L'umidità è importante, come si vuole evitare l'evaporazione. È possibile utilizzare uno standard di incubatore di mammifero posto in un frigorifere con controllo della temperatura impostata a 23 ° C.

IV. DDM1 un terreno specifico per la coltivazione delle culture

1. Fai DMEM: A 100 ml di Ham F12/DME Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052).
   1. Aggiungere 0,476 g Hepes (20mm) (Sigma # H-3375). Mix.
   2. Aggiungere 1,25 ml di L-Glutammina 200 mm (Irvine Scientific # 9317). Mix.
   3. Filtro in cappa con filtro 0,2 micron siringa acetato (bisogno di 2 filtri).
   4. Il pH è 6.64 e Osm 288.
   5. Fai aliquote di 10 ml in provette da 15 ml.
   6. Conservare a 4 ° C per non più di 2 settimane.
      
      Nota: utilizzare sempre in autoclave acqua filtrata e fare in contenitori che sono riservati per i Media e supplementi solo. Non mettere mai un elettrodo pH o mescolate a barre utilizzati per altri scopi in Media.To fare DDM1: integratori Aggiungi elencati di seguitodi DMEM appena prima coltura.
      
      
2. A 10 ml di DMEM aggiungere:
   • 100 ul transferrina
   • Putrescine 100 microlitri
   • Selenio 100 microlitri
   • Progesterone 100 microlitri
   • 50 microlitri insulina

Discussion

Nelle culture Drosophila preparati da embrioni fase midgastrula i neuroni derivano da precursori neuroblasti, molte delle quali dividono prima differenziazione in vitro. Questo sistema offre così un'occasione unica per esplorare i fattori genetici e ambientali importanti in fasi molto precoci dello sviluppo neuronale (Rohrbaugh et al., 2003). Abbiamo dimostrato che i neuroni coltivati ​​in un mezzo semplice definito differenziarsi in neuroni elettricamente eccitabili, che formano anche funzionale connessioni sinaptiche (O Dowd, 1995; Lee e O Dowd, 1999). Attraverso l'analisi di mutanti e / o manipolazioni farmacologiche, in combinazione con tecniche di cella standard intero sistema di registrazione questo modello può essere utilizzato per esplorare il ruolo dei geni e fattori ambientali coinvolti nello sviluppo di eccitabilità elettrica e la trasmissione sinaptica (Hodges et al, 2002;. Lee e O Dowd, 2000; Lee et al, 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.