Summary
이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 중탄산염 기반 정의 매체 성장 2 일 후에 도금과 차별화된 뉴런 후 세포를 1 시간 보여줍니다. 뉴런은 전기 고르기하고 시냅스 연결을 형성합니다.
Abstract
이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화를 만들기위한 절차를 설명합니다. 표백제를 사용하는 배아하고 dechorionation를 수집하기 위해 방법은 증명하고 있습니다. 입 흡입 튜브에 부착된 유리 pipet을 사용하여, 우리는 하나의 배아에서 세포의 제거를 보여줍니다. uncoated 유리 coverslip에 대한 매체의 작은 (5 L) 드롭으로 각 embyro에서 세포를 분산하는 방법을 시연합니다. 도금 후 1 시간에 현미경을 통해보기 원하는 세포 밀도를 보여줍니다. 정의 매체 자라면 생존 세포의 대부분은 12-24시간로 neuritic 프로세스를 확장하기 전에 문화를 한 번 이상 나누어 neuroblasts 있습니다. 현미경을 통해 볼 수 neurite 가지의 수준을 보여줍니다과 체외에서 이일에 건강한 문화의 예상 분기. 문화가 22-24 ° C.에서 5 % CO 2 배양기에서 정의된 매체를 기반으로 간단한 중탄산염에서 재배 Neuritic 프로세스는 문화의 첫 번째 주 동안 정교한 계속하고 그들은 종종 기능 시냅스 연결을 형성 인접 세포에서 neurites과 접촉을 때. 이러한 문화의 뉴런 전압 - 게이 티드 나트륨, 칼슘, 그리고 칼륨 채널을 표현하고 전기 고르기가 있습니다. 이 문화 시스템의 연결을 차별화, 흥분, 그리고 버렸네 형성 / 기능을 조절 분자 유전과 환경 요인을 공부하는 데 유용합니다.
Protocol
I. Drosophila의 배아 컬렉션
- 달걀 수집 번호판을 준비
- 8g의 한천과 함께 삶아 200 ML DH 2 O
- 50 쿨 ° C
- 2 ML EtOH 2 ML 초산 추가
- 35mm 플라스틱 배양 접시, 정상에 따르다
- 4 쿨 공기 꽉 컨테이너에 가게 ° C
- 약 80 접시를 만듭니다
- 효모 붙여넣기 준비
- 붙여넣기 양식 물에 Fleishmans 적극적인 제빵 효모를 디졸브
- 누룩을 죽일 20-30초에 대한 마이크 로파 (끓어에 대한 조심)
- 4 ° C에 대한 이주 10 CC 주사기 (바늘없이)에 저장
- 파리 : 달걀 수집에 사용되는 어른들이 신선한 음식에 접근할 수 있었 것을 제공하고, 3시 사이에 14 일 신흥 후 일반적으로 가장 비옥한 있습니다. 대부분의 돌연변이 주식 계란 누워있는 그들이 가장 생산되는의 시대에 변화의 인하 속도에 자신을 매니 페스트 수 있습니다 다산을 감소했습니다. 일반적으로, 수백 성인은 좋은 계란 - 누워있는 인구에 대한합니다.
- 절차 : 달걀 수집 접시에 붙여넣 효모의 얇은 레이어를 펴. 이것은 계란의 부설을위한 유리한 기판을 제공합니다. 전송 성인 병의 입구에 깨끗한 달걀 수거 용기 및 테이프 수집 판을 난다. 습도가 상승하고 파리가 붙여넣기와 병의 양쪽에 붙어가는대로 더 이상 3~4시간보다 이런 병에 파리를 두지 마십시오.
II. 블리치와 함께 배아 Dechorionation
- 흡인기에 부착된 필터 플라스크에 연결된 부흐너 퍼널을 설정합니다. 퍼널의 왓먼 # 1 종이를 넣어. 흡입을 실행으로 멸균 증류수로 종이가 젖었어.
- 세척 병의 물 흐름으로 여과지에 수집 접시에서 배아를 씻어.
- 멸균 물 몇 권에서 그들을 린스, 흡인기를 해제하고, 다음 50 % 표백제의 퍼널 볼륨을 추가합니다. 계란 5-10 분 정도 앉아 보자. chorions는 1-2분에 녹아있는,하지만 더 이상 당신이 훼손 효모의 이상이 파괴되는 표백제의 배아를 떠날 것입니다. 접시를 씻어서 갖고있는 성인이나 애벌레를 선택하십시오.
- 멸균 증류수와 멸균 페트리 접시 (조직 배양되지 않음)에 배아를 씻어. 그것이 미리 침수되지 않은 경우 배아의 많은 접시의 바닥에 붙어 것입니다. 이 접시에 멸균 물을 여러 번 씻어.
- 중간 gastrula 단계 배아를 선택할 전송 빛의와 태아를 검사합니다.
III. 단일 배아 문화의 준비
- DDM1를 (섹션 IV의 요리법 참조) 확인
- 직전 culturing에 배아의 그릇에서 물을 붓다. 무균 미디어와 배아를 커버.
- 3, 35mm 배양 접시를 설정합니다. 각 접시 4 autoclaved 원형 coverslips 넣어. 각 coverslip에 중간 5 μl를 넣어. Bellco coverslips - 낮은 납 유리 coverlips을 사용합니다.
Bellco 생물 유리
800-257-7043
고양이 # 1943-00012 - 몇 가지 매우 좋은 pipets을 당기세요. 우리가 사용하는 pipets는 Narishige PP - 83의 풀러에 뽑아 있습니다. pipet의 정확한 크기는 중요하지 않습니다 우리는 보통 우리가 원하는보다 세밀한들을 뽑아 그들의 크기를 측정하기 위해 배아로보기 같은 분야의 팁을를 끊다. 한 가지의 배아를 모두 빨아 싶지 않다, 그리고 그것이 조직을 빨아 5 분 정도 소요되는 끝 이렇게 작은 싶지 않아요. 어딘가 사이에 목표. 전송 빛의와 배아를 검사하고 배아의 내용을 제거 pipet에 연결된 입 흡입 튜브를 사용합니다. 가능한 coverslip 가까운 부드럽게 세포를 추방하여 준비 coverslip에 세포를 해산. 당신은 높은 전력에서 coverslips을 검사할 더 나아가 같은 방법으로 세포를 흩어 수 있습니다.
- 전지은 10 분이다 위해 앉아 보자. 홍수는 미디어와 접시와 인큐베이터에 넣어 4-5 %의 CO 2 환경 정의 매체를 사용하는 경우. 22-24 사이의 온도 ° C. 우리는 일상적으로 23 ° C와 95 %의 습도를 사용합니다. 습도는 증발을 피하기 위해 원하는만큼 중요합니다. 당신은 23으로 설정 온도 제어와 coldroom에 배치 표준 포유 동물 배양기 ° C.를 사용할 수 있습니다
IV. 문화를 성장을위한 DDM1 정의 매체
- 100 햄의 F12/DME 미디어 (DMEM) (어바인 과학 # 9052)의 MLS :. DMEM 만들기
- 0.476 g Hepes (20mM) (시그마 #은 H - 3375)를 추가합니다. 섞는다.
- 1.25 ML L - 글루타민 200 MM을 (# 9317 어바인 과학) 추가합니다. 섞는다.
- 0.2 μm의 아세테이트 주사기 필터 (2 필터가 필요)와 후드 필터.
- 산도는 6.64 및 Osm 288입니다.
- 15ml 원심 튜브에 10ml의 aliquots하십시오.
- 4 스토어 ° C 이상의 이주되지 않습니다.
참고 : 항상 미디어와 보조제만을 위해 예약된 용기에 autoclaved 필터링된 물을 사용합니다. 아래 추가 보조 : 산도 전극을 넣어하거나 Media.To 다른 목적을 위해 사용 막대를 저어 쓰지 DDM1을culturing에 DMEM하기 직전.
- DMEM 추가의 10 MLS :
- 100 μl 트랜스페린
- 100 μl Putrescine
- 100 μl 셀레늄
- 100 μl Progesterone
- 50 μl 인슐린
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
midgastrula 스테이지 배아에서 준비 Drosophila 문화에서 뉴런은 체외에서 분화하기 전에 분할 많은 중 neuroblast의 엽 성의 전구 물질에서 발생. 이 시스템의 연결을 따라서 개발의 매우 초기 단계 (로보어 외., 2003)에서 중요한 유전과 환경 요인의 탐험에 대한 독특한 기회를 제공합니다. 우리는 간단한 정의 매체 성장 뉴런도 (; 리 O 다우드, 1999 O 다우드, 1995) 기능 시냅스 연결을 형성 전기 고르기 뉴런으로 차별화하는 것으로 나타났습니다. .이 모델 시스템은 전기 흥분과 시냅스 전송 (하지스 외, 2002 년 개발에 관련된 역할 유전자와 환경 요인을 탐구하는 데 사용할 수있는 표준 전체 세포 녹음 기술과 함께, 돌연변이 및 / 또는 약리 조작의 분석을 사용하여, 리 그리고 O 다우드, 2000; 리 외, 2003)..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 DKOD에 NIH 부여 NS27501에 의해 지원되었다. HHMI 교수 부여에서 DKOD이 작업에 대한 추가 지원합니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
| Transferrin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
| Petri dishes | ||||
| Cover-slips | Bellco Glass | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
| Paper filter | Whatman, GE Healthcare | #1 | ||
| 10cc syringe | Tool | |||
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media. |
||||
References
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).
