Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

Summary

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Puntos de vista de las culturas show en vivo de las células de una hora después de la siembra y las neuronas diferenciadas después de 2 días de crecimiento en un medio de bicarbonato definido. Las neuronas son eléctricamente excitables y forman conexiones sinápticas.

Abstract

Este video muestra el procedimiento para la toma de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Los métodos de recogida de embriones y su dechorionation el uso de cloro se ha demostrado. Con una pipeta de vidrio conectado a un tubo de succión de la boca, que ilustran la eliminación de todas las células de los embriones individuales. El método para la dispersión de las células de cada embyro en una pequeña (5 litros) gota de medio en un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento se demuestra. Una vista a través del microscopio menos 1 hora después de la siembra ilustra la densidad celular preferida. La mayoría de las células que sobreviven cuando se cultivan en un medio definido son los neuroblastos que dividen a una o más veces en la cultura antes de extender los procesos de neuríticas por 12-24 horas. Una vista a través del microscopio muestra el nivel de crecimiento de las neuritas y la ramificación se espera en una cultura sana en 2 días in vitro. Los cultivos se envían en un bicarbonato de simple basada medio definido, en un 5% de CO ₂ incubadora a 22-24 ° C. Procesos neuríticas siga elaborando durante la primera semana de la cultura y cuando hacen contacto con neuritas de las células vecinas a menudo se forman conexiones sinápticas funcionales. Las neuronas en estas culturas, se manifiestan de voltaje de sodio, calcio, y los canales de potasio y son eléctricamente excitables. Este sistema de cultivo es útil para el estudio molecular de factores genéticos y ambientales que regulan la diferenciación neuronal, la excitabilidad, y la formación de sinapsis / función.

Protocol

I. Drosophila de recogida de embriones

1. Preparar las placas de recolección de huevos
   1. Hervir 200 ml dH ₂ O con 8 g de agar
   2. Enfriar a 50 ° C
   3. Añadir 2 ml de EtOH y 2 ml de ácido acético
   4. Vierta la mezcla en 35 mm placas petri de plástico, tapas
   5. Dejar enfriar y guardar en un recipiente hermético a 4 º C
   6. Hace aproximadamente 80 placas
2. Preparar pasta de levadura
   1. Disolver la levadura para hornear Fleishmans activo en agua para formar una pasta
   2. Microondas por 20-30 segundos para matar la levadura (cuidado con los hirviendo)
   3. Tienda en jeringa de 10 cc (sin aguja) a 4 ° C durante 2 semanas
3. Moscas: Los adultos utilizados para la recolección de huevos son generalmente más productivos entre los 3 y 14 días después de salir, siempre y cuando hayan tenido acceso a los alimentos frescos. Muchas poblaciones de mutantes tienen disminución de la fertilidad que puede manifestarse en una tasa baja de la puesta de huevos y un cambio en la edad en que son más productivos. Por lo general, varios cientos de adultos para hacer una buena puesta de huevos de la población.
4. Procedimiento: Aplique una capa delgada de pasta de levadura en una placa de recolección de huevos. Esto proporciona un sustrato favorable para la puesta de huevos. Adultos transferencia vuela a una botella limpia y recolección de huevos de cintas de recogida de la placa en la boca de la botella. No deje que las moscas en estas botellas de más de 3-4 horas cuando la humedad aumenta y las moscas se atascan en pasta y en los lados de la botella.

II. Embrión Dechorionation con el blanqueo

1. Establecer un embudo Büchner conectado a un frasco de vacío conectado a un aspirador. Ponga un pedazo de papel Whatman # 1 en el embudo. Con aspiración correr, mojar el papel con agua destilada estéril.
2. Enjuague los embriones de las placas de colección en el papel de filtro con un chorro de agua de una botella de lavado.
3. Enjuague en varios volúmenes de agua estéril, apague aspirador, y luego agregar un volumen embudo del 50% de cloro. Deje que los huevos se sientan durante 5-10 minutos. El corion se disuelven en 1-2 minutos, pero cuanto más tiempo se deje a los embriones en el blanqueo más contaminante de la levadura será destruido. Escoja cualquier adultos o larvas que se han enjuagado plato.
4. Enjuague los embriones en una placa de Petri estéril (no el cultivo de tejidos) con agua destilada estéril. Muchos de los embriones se pegue en el fondo del plato si no ha sido previamente mojado. Enjuagar varias veces con agua estéril en este plato.
5. Examinar los embriones con la luz transmitida a escoger a mediados de gástrula embriones etapa.

III. Preparación de los cultivos de un solo embrión

1. Hacer DDM1 (ver recetas en la sección IV)
2. Vierta el agua fuera de plato de embriones justo antes de cultivo. Cubrir los embriones con medio estéril.
3. Establecido 3, 35 mm placas de Petri. Ponga en 4 cubreobjetos redondos autoclave en cada plato. En cada portaobjetos, poner 5 l de medio. Use Bellco cubreobjetos bajo coverlips de vidrio de plomo.
   
   Bellco Biológica Cristalería
   800-257-7043
   Cat # 1943-00012
   
   
4. Tire algunas pipetas bastante bien. El pipetas que usamos se tiran en una Narishige PP-83 extractor. Las dimensiones exactas de la pipeta no son esenciales y solemos tirar más fino de lo que quieren y les rompa la punta en el mismo campo de visión que el embrión para medir el tamaño. Usted no quiere a absorber todos los embriones de una sola vez, y tu no quieres la punta tan pequeña que se toma 5 minutos para absorber las células. Objetivo de un punto intermedio. Examinar los embriones con luz transmitida y el uso de un tubo de succión conectado a la boca de la pipeta para retirar el contenido del embrión. Dispersar las células en el portaobjetos preparados con cuidado la expulsión de las células lo más cerca posible del cubreobjetos como sea posible. Es posible que desee examinar el cubreobjetos con mayor potencia y mayor dispersión de las células de la misma manera.
5. Permitan que las células se siente por no más de 10 minutos. Inundar el plato con los medios de comunicación y poner en la incubadora, un 4-5% el medio ambiente de CO _2, si se utiliza un medio definido. Temperatura entre 22-24 º C. Nosotros usamos 23 ° C y 95% de humedad. La humedad es importante, ya que quieren evitar la evaporación. Usted puede utilizar un estándar de la incubadora de mamíferos colocado en una cámara frigorífica con el control de temperatura a 23 ° C.

IV. DDM1 medio definido para el cultivo de las culturas

1. Hacer DMEM: A 100 ml de F12/DME jamón en los Medios (DMEM) (Irvine Scientific # 9052).
   1. Añadir 0,476 g Hepes (20 mM) (Sigma N º H-3375). Mezcla.
   2. Añadir 1,25 ml de L-glutamina 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mezcla.
   3. Filtro de campana con jeringa de 0,2 micras filtro de acetato (necesita dos filtros).
   4. El pH es 6,64 y OSM 288.
   5. Hacer alícuotas de 10 ml en tubos de centrífuga de 15 ml.
   6. Almacenar a 4 ° C por no más de 2 semanas.
      
      Nota: Siempre use agua esterilizada filtrada y que en los envases que están reservados para los medios de comunicación y suplementos solamente. Nunca coloque un electrodo de pH o una barra de agitación utilizados para otros fines en Media.To hacer DDM1: Añadir suplementos se indican a continuaciónde DMEM justo antes de cultivo.
      
      
2. A 10 ml de DMEM añadir:
   • 100 l de transferrina
   • 100 putrescina l
   • Selenio 100 l
   • La progesterona 100 l
   • 50 La insulina l

Discussion

En cultivos de Drosophila preparado a partir de embriones etapa midgastrula las neuronas surgen a partir de precursores neuroblastos, muchos de los cuales se dividen antes de la diferenciación in vitro. Así, este sistema ofrece una oportunidad única para la exploración de los factores genéticos y ambientales importantes en las fases muy tempranas del desarrollo neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Hemos demostrado que las neuronas cultivadas en un medio simple definido diferenciarse en neuronas eléctricamente excitables, que también forma funcional de conexiones sinápticas (O Dowd, 1995; Lee y Dowd O, 1999). Utilizando el análisis de los mutantes y / o manipulaciones farmacológicas, en combinación con las técnicas estándar de células enteras de grabación puede ser este modelo de sistema utilizado para explorar el papel de genes y factores ambientales que intervienen en el desarrollo de la excitabilidad eléctrica y la transmisión sináptica (Hodges et al, 2002;. Lee y O Dowd, 2000; Lee et al, 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.