Préparation des cultures de neurones d'embryons de drosophile Midgastrula scène

Summary

Cette vidéo montre la préparation de cultures primaires de neurones d'embryons de drosophile midgastrula scène. Vues des cultures vivantes montrent les cellules 1 heure après le placage et les neurones différenciés après 2 jours de croissance dans un milieu à base de bicarbonate défini. Les neurones sont électriquement excitables et forment des connexions synaptiques.

Abstract

Cette vidéo illustre la procédure de mise cultures neuronales primaires d'embryons de drosophile midgastrula scène. Les méthodes de collecte des embryons et leur dechorionation utilisant l'eau de Javel sont démontrés. Aide d'une pipette en verre attaché à un tube d'aspiration bouche, nous illustrons l'élimination de toutes les cellules issues d'embryons unique. La méthode pour disperser les cellules d'embryons de chaque dans un petit (5 l) goutte de milieu sur une lamelle de verre sans revêtement est démontrée. Une vue à travers le microscope à 1 heure après le placage illustre la densité de cellule préférée. La plupart des cellules qui survivent lorsqu'elles sont cultivées en milieu défini sont neuroblastes qui divisent une ou plusieurs fois dans la culture avant d'étendre les processus neuritique par 12-24 heures. Une vue à travers le microscope illustre le niveau de la croissance des neurites et la ramification attendus dans une culture saine à 2 jours in vitro. Les cultures sont cultivées dans un milieu à base de bicarbonate de simples définis, dans un 5% de CO ₂ incubateur à 22-24 ° C. Processus neuritiques continuer à élaborer au cours de la première semaine de la culture et quand ils entrent en contact avec des neurites des cellules voisines, ils forment souvent des connexions synaptiques fonctionnelles. Les neurones de ces cultures d'exprimer voltage-dépendants sodium, le calcium, et les canaux potassiques et sont électriquement excitables. Ce système de culture est utile pour étudier moléculaires des facteurs génétiques et environnementaux qui régulent la différenciation neuronale, excitabilité et la formation des synapses / fonction.

Protocol

Collection I. embryon de drosophile

1. Préparer les plaques collecte des œufs
   1. Faire bouillir 200 ml dH ₂ O avec 8 g d'agar
   2. Laisser refroidir à 50 ° C
   3. Ajouter 2 ml de EtOH et 2 ml d'acide acétique
   4. Verser dans des boîtes de 35 mm de Petri en plastique, dessus
   5. Refroidir et conserver dans contenant hermétique à 4 ° C
   6. Donne environ 80 plaques
2. Préparer la pâte de levure
   1. Dissoudre la levure active Fleishmans de cuisson dans de l'eau pour former une pâte
   2. Micro-ondes pendant 20-30 secondes pour tuer la levure (attention aux bouillante sur)
   3. Stocker dans une seringue de 10 cc (sans aiguille) à 4 ° C pendant 2 semaines
3. Mouches: Les adultes utilisés pour la collecte d'œufs sont généralement plus productives entre 3 et 14 jours après son apparition, pourvu qu'ils aient eu accès à des aliments frais. De nombreux stocks de mutants ont diminué de fertilité qui peut se manifester à un taux réduit de la ponte et un changement dans l'âge où ils sont plus productifs. Généralement, plusieurs centaines d'adultes font pour une bonne ponte de la population.
4. Procédure: Étendre une mince couche de levure pâte sur une plaque de collecte des œufs. Cela fournit un substrat favorable à la ponte des œufs. Transfert adulte vole à une bouteille de collecte des œufs propres et la plaque de collection de bandes à l'embouchure de la bouteille. Ne laissez pas les mouches dans ces bouteilles plus longtemps que 3-4 heures que l'humidité augmente et les mouches se coincer dans la pâte et sur les côtés de la bouteille.

II. Dechorionation Embryon avec javellisant

1. Mettre en place un entonnoir Büchner relié à un flacon de filtre attaché à un aspirateur. Placer un morceau de papier Whatman n ° 1 dans l'entonnoir. Avec aspiration course, mouiller le papier avec de l'eau distillée stérile.
2. Rincez embryons à partir de plaques de collecte sur le papier filtre avec un jet d'eau à partir d'un flacon de lavage.
3. Rincez-les en plusieurs volumes d'eau stérile, éteignez l'aspirateur, puis ajoutez un volume d'entonnoir d'eau de Javel à 50%. Laissez les œufs reposer pendant 5-10 minutes. Le chorions sera dissoute en 1-2 minutes, mais plus vous laissez les embryons dans l'eau de javel plus de la levure contaminant seront détruits. Ramassez tous les adultes ou les larves qui ont rincé plat.
4. Rincez les embryons dans une boîte de Pétri stérile (culture de tissus non) avec de l'eau distillée stérile. Beaucoup des embryons sera coller au fond du plat si elle n'a pas été pré-mouillé. Rincez plusieurs fois à l'eau stérile dans ce plat.
5. Examiner les embryons avec la lumière transmise à repérer embryons au stade mi-gastrula.

III. Préparation des cultures d'embryon unique

1. Faire DDM1 (voir les recettes dans la section IV)
2. Versez de l'eau hors plat du embryons juste avant la culture. Couvrir avec les médias embryons stérile.
3. Énoncer 3, 35 mm des boîtes de Pétri. Mettre en 4 lamelles rondes autoclavés dans chaque plat. Sur chaque lamelle, mettre 5 pi de milieu. Utilisez Bellco lamelles basse coverlips verre au plomb.
   
   Bellco biologique Verrerie
   800-257-7043
   Cat # 1943-00012
   
   
4. Tirez quelques pipettes assez fine. Les pipettes nous utilisons sont tirés sur une Narishige PP-83 extracteur. Les dimensions exactes de la pipette ne sont pas cruciaux et nous avons l'habitude de les tirer plus fine que nous voulons et les casser la pointe dans le même champ de vision comme l'embryon d'évaluer la taille. Vous ne voulez pas d'aspirer tous les embryons d'un seul coup, et ne voulons pas de votre bout si petit qu'il faut 5 minutes pour aspirer les cellules. Visez entre les deux. Examiner les embryons à lumière transmise et d'utiliser un tube d'aspiration la bouche attachée à la pipette pour retirer le contenu de l'embryon. Disperser les cellules sur la lamelle délicatement préparé par l'expulsion des cellules aussi proche de la lamelle que possible. Vous voudrez peut-être examiner les lamelles à haute puissance et encore de disperser les cellules de la même manière.
5. Laissez reposer pendant les cellules ne sont plus que 10 minutes. Recouvrir le plat avec les médias et mis en couveuse, 4-5% CO ₂ l'environnement, si on utilise un milieu défini. Température entre 22-24 ° C. Nous utilisons régulièrement 23 ° C et une humidité de 95%. L'humidité est importante, comme vous voulez éviter l'évaporation. Vous pouvez utiliser une norme incubateur mammifères placés dans une chambre froide avec contrôle de température réglée à 23 ° C.

IV. Moyennes DDM1 Définie pour la croissance des cultures

1. Faire DMEM: Pour 100 ml de Ham F12/DME médias (DMEM) (Irvine Scientific # 9052).
   1. Ajouter 0,476 g Hepes (20mm) (Sigma # H-3375). Mélanger.
   2. Ajouter 1,25 ml de L-glutamine 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mélanger.
   3. Filtre de hotte avec 0,2 um acétate de filtre seringue (besoin de 2 filtres).
   4. Le pH est 6,64 et OSM 288.
   5. Faire des aliquotes de 10 ml dans des tubes de centrifugeuse de 15 ml.
   6. Conserver à 4 ° C pendant pas plus de 2 semaines.
      
      Remarque: Toujours utiliser l'eau filtrée et autoclavés font dans des conteneurs qui sont réservées pour les médias et les suppléments seulement. Ne mettez jamais une électrode de pH ou le barreau d'agitation utilisé à des fins autres Media.To font DDM1: suppléments Ajouter énumérés ci-dessousau DMEM juste avant la culture.
      
      
2. Pour 10 ml de DMEM ajouter:
   • 100 ul de la transferrine
   • 100 ul Putrescine
   • 100 Sélénium ul
   • 100 ul de progestérone
   • 50 ul insuline

Discussion

Dans les cultures préparées à partir de la drosophile embryons au stade midgastrula les neurones proviennent de précurseurs neuroblastes, dont beaucoup divisent avant de différenciation in vitro. Ce système offre donc une occasion unique d'étudier les facteurs génétiques et environnementaux importants dans des phases très précoces du développement neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Nous avons montré que les neurones cultivés dans un milieu simple défini différencier en neurones électriquement excitables qui a également une forme fonctionnelle des connexions synaptiques (O Dowd, 1995; Lee et O Dowd, 1999). En utilisant l'analyse de mutants et / ou des manipulations pharmacologiques, en combinaison avec les techniques d'enregistrement standard de l'ensemble des cellules ce système modèle peut être utilisé pour explorer le rôle et les gènes des facteurs environnementaux impliqués dans le développement de l'excitabilité électrique et la transmission synaptique (Hodges et al, 2002;. Lee et O Dowd, 2000; Lee et al, 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.