Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

Summary

Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus midgastrula Bühne Drosophila-Embryos. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Zellen 1 Stunde nach dem Ausplattieren und differenzierten Neuronen nach 2 Tagen Wachstum in einem Bicarbonat-basierten definiertem Medium. Die Neuronen sind elektrisch erregbar und bilden synaptische Verbindungen.

Abstract

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus midgastrula Bühne Drosophila-Embryos. Die Methoden für die Erhebung Embryonen und ihre dechorionation mit Bleichmittel demonstriert. Mit einer Glaspipette an einem Mund-Saugrohr, illustrieren wir die Entfernung aller Zellen, die aus einzelnen Embryonen. Das Verfahren zum Dispergieren Zellen aus jeder embyro in einen kleinen (5 l) Tropfen Medium auf einer unbeschichteten Deckglas wird demonstriert. Ein Blick durch das Mikroskop bei 1 Stunde nach dem Ausplattieren zeigt die bevorzugte Zelldichte. Die meisten der Zellen, wenn in definierten Medium überleben Neuroblasten, dass ein oder mehrere Male in der Kultur teilen, bevor Erweiterung neuritischen Prozesse durch 12-24 Stunden. Ein Blick durch das Mikroskop zeigt den Grad der Neuritenwachstum und Verzweigung in eine gesunde Kultur in 2 Tage in vitro zu erwarten. Die Kulturen werden in einer einfachen Bicarbonat Basis definiert Medium, in einer 5% CO _2-Inkubator bei 22-24 ° C. Neuritischen Prozesse weiter zu erarbeiten über die erste Woche in der Kultur, und wenn sie in Kontakt mit Neuriten aus dem benachbarten Zellen bilden sie oft funktionelle synaptische Verbindungen. Neuronen in diesen Kulturen auszudrücken spannungsabhängigen Natrium, Kalzium und Kalium-Kanälen und sind elektrisch erregbar. Diese Kultur ist nützlich für die Untersuchung molekularer genetischen und umweltbedingten Faktoren, die neuronale Differenzierung, Erregbarkeit und Synapsenbildung / Funktion zu regulieren.

Protocol

I. Drosophila Embryo-Entnahme

1. Bereiten Eiersammlung Platten
   1. Kochen 200 ml dH ₂ O mit 8 g Agar
   2. Abkühlen auf 50 ° C
   3. 2 ml EtOH und 2 ml Essigsäure
   4. Gießen Sie in 35 mm Kunststoff-Petrischalen, Tops
   5. Cool und speichern in luftdichten Behälter bei 4 ° C
   6. Ergibt ca. 80 Teller
2. Bereiten Hefepaste
   1. Lösen Sie Fleishmans aktive Backhefe in Wasser zu fügen
   2. Mikrowelle für 20-30 Sekunden, um Hefe zu töten (achten Sie auf Überkochen)
   3. Shop in 10 ml-Spritze (ohne Kanüle) bei 4 ° C für 2 Wochen
3. Fliegen: Die Erwachsenen für Eiersammlung werden in der Regel am produktivsten zwischen 3 und 14 Tage nach dem Austritt, sofern sie hatten Zugang zu frischen Lebensmitteln. Viele Mutanten Aktien haben die Fruchtbarkeit, die manifestiert sich in einer abgesenkten Satz von der Eiablage und eine Veränderung in dem Alter, in dem sie am produktivsten sind gesunken. Generell machen mehrere hundert Erwachsene für einen guten Eiablage Bevölkerung.
4. Vorgehensweise: Verteilen Sie eine dünne Schicht von Hefe auf einem Ei Sammlung Platte einfügen. Dies bietet ein günstiges Substrat für die Eiablage. Transfer erwachsenen Fliegen auf eine saubere Entnahme der Eizellen Flasche und Band der Sammlung Platte an der Mündung der Flasche. Lassen Sie das Fliegen in dieser Flaschen länger als 3-4 Stunden, da die Luftfeuchtigkeit steigt und die Fliegen zu bekommen in Paste und auf Seiten der Flasche stecken.

II. Embryo Dechorionation mit Bleach

1. Richten Sie einen Büchner-Trichter an eine Saugflasche an einen Aspirator. Legen Sie ein Stück Whatman Papier Nr. 1 in den Trichter. Mit Saug-laufen, nass das Papier mit sterilem destilliertem Wasser.
2. Spülen Embryonen aus der Sammlung Platten auf das Filterpapier mit einem Strom von Wasser aus einer Spritzflasche.
3. Spülen Sie sie in mehreren Bänden von sterilem Wasser, schalten Sie Aspirator, und fügen Sie dann einen Trichter von 50% Bleichmittel. Lassen Eiern sitzen 5-10 Minuten. Das Chorion wird in 1-2 Minuten aufgelöst werden, aber je länger Sie verlassen die Embryonen in der Bleiche die mehr der kontaminierenden Hefe zerstört werden. Suchen Sie sich keine Erwachsenen oder Larven, die aus Schale haben gespült.
4. Spülen Sie die Embryonen in eine sterile Petrischale (NICHT Gewebekultur) mit sterilem destilliertem Wasser. Viele der Embryonen wird der Boden der Schale haften, wenn es nicht bereits vorher benetzt. Spülen Sie mehrmals mit sterilem Wasser in dieses Gericht.
5. Untersuchen Sie die Embryonen mit Durchlicht herausgreifen Mitte Gastrulastadium Embryonen.

III. Vorbereitung der einzelnen Embryokulturen

1. Machen DDM1 (siehe Rezepte in Abschnitt IV)
2. Gießen Sie Wasser aus Schüssel von Embryonen kurz vor dem Züchten. Abdeckung Embryonen mit sterilen Medien.
3. Set aus 3, 35 mm Petrischalen. Legen Sie in 4 autoklaviert runden Deckgläschen in jedem Gericht. Auf jedem Deckglas, legte 5 ul Medium. Verwenden Sie Bellco Deckgläser-low Bleiglas coverlips.
   
   Bellco Biological Glaswaren
   800-257-7043
   Cat # 1943-00012
   
   
4. Ziehen Sie einige ziemlich feinen Pipetten. Die Pipetten verwenden wir sind auf einem Narishige PP-83 Abziehers. Die genauen Abmessungen der Pipette sind nicht entscheidend und wir in der Regel ziehen sie feiner als wir wollen, und sie brechen Sie die Spitze in der gleichen Sichtfeld wie der Embryo, um die Größe zu messen. Sie wollen nicht zu saugen alle Embryonen in einem Rutsch, und Ihr nicht wollen, dass die Spitze so klein, dass es 5 Minuten dauert, saugen die Zellen. Ziel für irgendwo dazwischen. Untersuchen Sie die Embryonen mit Durchlicht und mit einem Mund Saugrohr an der Pipette, um den Inhalt des Embryos zu entfernen. Disperse die Zellen auf die vorbereitete Deckglas durch vorsichtiges Vertreibung der Zellen, um die Deckglas nah wie möglich. Vielleicht möchten Sie die Deckgläser mit höherer Leistung zu prüfen und weiter zu verstreuen die Zellen in der gleichen Weise.
5. Lassen Sie die Zellen sitzen nicht länger als 10 Minuten. Flood die Schüssel mit den Medien und setzen in Inkubator, 4-5% CO _2-Umgebung, wenn mit Hilfe von definierten Medium. Temperatur zwischen 22-24 ° C. Wir verwenden routinemäßig 23 ° C und 95% Luftfeuchtigkeit. Feuchtigkeit ist sehr wichtig, da Sie, um Verdunstung zu vermeiden möchten. Sie können eine Standard-Säugetier-Inkubator in einer Kühlzelle mit Temperaturkontrolle platziert wurde auf 23 ° C

IV. DDM1 definiertem Medium für den Anbau der Kulturen

1. Machen DMEM: Zu 100 ml Ham F12/DME Medien (DMEM) (Irvine Scientific # 9052).
   1. Add 0,476 g Hepes (20 mm) (Sigma # H-3375). Mix.
   2. Add 1,25 ml L-Glutamin 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mix.
   3. Filter in Kapuze mit 0,2 mu m Acetat-Spritzenfilter (need 2 Filter).
   4. Der pH-Wert ist 6.64 und Osm 288.
   5. Machen Aliquots von 10 ml in 15ml-Zentrifugenröhrchen.
   6. Lagerung bei 4 ° C für nicht länger als 2 Wochen.
      
      Hinweis: Verwenden Sie immer autoklaviert gefiltertem Wasser und in Containern, die für Medien und Ergänzungen vorbehalten sind zu machen. Niemals einer pH-Elektrode oder Rührstab für andere Zwecke in Media.To verwendet machen DDM1: In Ergänzung unten aufgeführtenzu DMEM kurz vor Kultivierung.
      
      
2. Zu 10 ml DMEM hinzufügen:
   • 100 ul Transferrin
   • 100 ul Putrescin
   • 100 ul Selenium
   • 100 ul Progesteron
   • 50 pl Insulin

Discussion

In Drosophila Kulturen aus midgastrula Embryonen bereitete den Neuronen entstehen aus Neuroblasten Vorläufer, von denen viele vor der Differenzierung in vitro zu teilen. Dieses System bietet somit eine einmalige Gelegenheit für die Exploration von genetischen und umweltbedingten Faktoren wichtig in sehr frühen Phasen der neuronalen Entwicklung (Rohrbaugh et al., 2003). Wir haben gezeigt, dass Neurone in einer einfachen Definition-Medium in elektrisch erregbaren Neuronen, bilden auch funktionelle synaptische Verbindungen (O Dowd, 1995; Lee und O Dowd, 1999) zu unterscheiden. Mit Analyse von Mutanten und / oder pharmakologischen Manipulationen, in Kombination mit Standard-Ganzzell Aufnahmetechniken dieses Modell verwendet, um die Rolle Gene und Umweltfaktoren in der Entwicklung der elektrischen Erregbarkeit und synaptische Übertragung (Hodges et al, 2002 beteiligt erkunden können;. Lee und O Dowd, 2000; Lee et al, 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.