De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo's

Summary

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

Abstract

Deze video illustreert de procedure voor het maken van de primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. De methoden voor het verzamelen van embryo's en hun dechorionation met behulp van bleekwater worden gedemonstreerd. Met behulp van een glazen pipet aan een mond zuigbuis, illustreren we de verwijdering van alle cellen van een embryo's. De methode voor het dispergeren van cellen uit elk embyro in een kleine (5 l) druppel medium op een ongecoat glas dekglaasje is aangetoond. Een blik door de microscoop op 1 uur na plating illustreert de voorkeur celdichtheid. Het merendeel van de cellen die overleven wanneer ze groeien in beschreven medium zijn neuroblasts dat een of meer keer in de cultuur te verdelen voor de uitbreiding neuritische processen 12-24 uur. Een blik door de microscoop illustreert het niveau van de neurietuitgroei en vertakking naar verwachting in een gezonde cultuur in 2 dagen in vitro. De cultures worden gekweekt in een eenvoudige bicarbonaat op basis van beschreven medium, in een 5% CO ₂ incubator bij 22-24 ° C. Neuritische processen verder uit te werken over de eerste week in de cultuur en wanneer ze contact maken met de neurieten van naburige cellen die ze vormen vaak functionele synaptische verbindingen. Neuronen in deze culturen te uiten voltage-gated natrium, calcium en kalium kanalen en worden elektrisch opgewonden. Deze cultuur systeem is nuttig voor het bestuderen van moleculaire genetische en omgevingsfactoren die neuronale differentiatie, prikkelbaarheid, en synapsvorming / functie te reguleren.

Protocol

I. Drosophila embryo

1. Bereid ei collectie platen
   1. Kook 200 ml dH ₂ O met 8 g agar
   2. Afkoelen tot 50 ° C
   3. Voeg 2 ml EtOH en 2 ml azijnzuur
   4. Giet het mengsel in 35 mm plastic petrischaaltjes, tops
   5. Cool en op te slaan in luchtdichte container bij 4 ° C
   6. Maakt ongeveer 80 platen
2. Bereid Gist plakken
   1. Los Fleishmans bakkersgist in water om vorm te plakken
   2. Magnetron gedurende 20-30 seconden om gist te doden (pas op voor overkoken)
   3. Op te slaan in 10 cc spuit (zonder naald) bij 4 ° C voor 2 weken
3. Vliegen: De volwassenen worden gebruikt voor het verzamelen van eieren zijn over het algemeen het meest productief tussen 3 en 14 dagen na opkomst, op voorwaarde dat zij toegang hebben tot vers voedsel had. Veel mutant voorraden zijn afgenomen vruchtbaarheid dat zich kan manifesteren in een verlaagde tarief van de eileg en een verandering in de leeftijd waarop zij het meest productief zijn. In het algemeen, enkele honderden volwassenen te maken voor een goede leg bevolking.
4. Procedure: Spreid een laagje gist pasta op een ei collectie plaat. Dit zorgt voor een gunstige voedingsbodem voor het leggen van eieren. Overdracht volwassen vliegen om een ​​schone ei collectie fles en tape de collectie plaat aan de mond van de fles. Laat de vliegen in deze flessen langer dan 3-4 uur als de luchtvochtigheid stijgt en de vliegen blijven steken in plakken en aan de zijkanten van de fles.

II. Embryo Dechorionation met Bleach

1. Stel een Buchner-trechter is aangesloten op een filtreerkolf gekoppeld aan een afzuiger. Leg een stuk Whatman # 1 papier in de trechter. Met afzuiging draait, nat het papier met steriel gedestilleerd water.
2. Spoel embryo's uit de collectie van platen op het filter papier met een stroom van water uit een spuitfles.
3. Spoel ze in verschillende volumes steriel water, uit te schakelen afzuiger, en voeg vervolgens een trechter volume van 50% bleekwater. Laat de eieren zitten 5-10 minuten. De chorions zal worden opgelost in 1-2 minuten, maar hoe langer je laat de embryo's in het bleekmiddel het meer van de vervuilende gist zal worden vernietigd. Kiezen uit een volwassenen of larven die zijn afgespoeld schotel.
4. Spoel de embryo's in een steriele petrischaal (NIET weefselkweek) met steriel gedestilleerd water. Veel van de embryo's blijft plakken aan de bodem van de schaal, indien het niet vooraf bevochtigd. Spoel verschillende keren met steriel water in dit gerecht.
5. Onderzoek van de embryo's met doorgelaten licht te halen uit mid-gastrulastadium embryo's.

III. De voorbereiding van single embryo culturen

1. Maak DDM1 (zie de recepten in deel IV)
2. Giet het water af schotel van embryo's vlak voor het kweken. Bedek embryo's met steriele media.
3. Uiteengezet 3, 35 mm petrischaaltjes. Zet in 4 geautoclaveerde ronde dekglaasjes in elk gerecht. Op elke dekglaasje, zet 5 ul medium. Gebruik Bellco coverslips-low loodglas coverlips.
   
   Bellco Biologische Glaswerk
   800-257-7043
   Cat # 1943 tot 00,012
   
   
4. Trek een aantal vrij goede pipetten. De pipetten die wij gebruiken zijn getrokken op een Narishige PP-83 trekker. De exacte afmetingen van de pipet niet cruciaal en we meestal trek ze fijner dan we willen en ze afbreken van de tip in hetzelfde gezichtsveld als het embryo om de grootte te meten. Je wilt niet op te zuigen al van de embryo's in een keer, en je niet wilt dat de tip zo klein dat het 5 minuten duurt om zuigen de cellen. Streven naar ergens tussenin. Onderzoek van de embryo's met doorvallend licht en gebruik van een mond zuigbuis aan de pipet om de inhoud van het embryo te verwijderen. De verspreiding van de cellen op de voorbereide dekglaasje door voorzichtig het verdrijven van de cellen als het dekglaasje dicht mogelijk. U kunt de dekglaasjes te onderzoeken bij een hogere macht en verder de cellen verspreiden op dezelfde manier.
5. Laat de cellen zitten voor niet langer dan 10 minuten. Flood de schotel met de media en zet in de broedstoof, 4-5% CO _2-omgeving, als u gedefinieerd medium. Temperatuur tussen 22-24 ° C. We routinematig gebruik van 23 ° C en 95% luchtvochtigheid. Luchtvochtigheid is belangrijk, als je wilt om verdamping te voorkomen. U kunt gebruik maken van een standaard zoogdieren incubator geplaatst in een coldroom met temperatuurregeling ingesteld op 23 ° C.

IV. DDM1 Gedefinieerd medium voor het kweken van de culturen

1. Maak DMEM: Aan 100 ml van Ham's F12/DME Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052).
   1. Voeg 0,476 g Hepes (20mm) (Sigma # H-3375). Mix.
   2. Voeg 1,25 ml L-Glutamine 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mix.
   3. Filter in kap met 0,2 micrometer acetaat spuitfilter (moeten 2 filters).
   4. De pH is 6,64 en 288 Osm.
   5. Maak porties van 10 ml in 15 ml centrifugebuis.
   6. Bewaren bij 4 ° C gedurende niet meer dan 2 weken.
      
      Opmerking: Gebruik altijd geautoclaveerd gefilterd water en maken in containers die zijn voorbehouden voor Media en supplementen alleen. Zet nooit een pH-elektrode of een roerstaafje gebruikt voor andere doeleinden in Media.To maken DDM1: Voeg een aanvulling op onderstaandenaar DMEM vlak voor het kweken van.
      
      
2. Tot 10 ml van DMEM toe te voegen:
   • 100 ul Transferrine
   • 100 ul putrescine
   • 100 ul Selenium
   • 100 ul Progesteron
   • 50 ul Insuline

Discussion

In Drosophila culturen bereid uit midgastrula stadium embryo's van de neuronen ontstaan ​​uit neuroblast voorlopers, waarvan vele delen voorafgaand aan de differentiatie in vitro. Dit systeem biedt dus een unieke gelegenheid voor de exploratie van genetische en omgevingsfactoren belangrijk in een zeer vroege fase van neuronale ontwikkeling (Rohrbaugh et al.., 2003). We hebben aangetoond dat neuronen gekweekt in een eenvoudige beschreven medium differentiëren in elektrisch prikkelbare neuronen die vormen ook functionele synaptische verbindingen (O Dowd, 1995; Lee en O Dowd, 1999). Met behulp van de analyse van mutanten en / of farmacologische manipulaties, in combinatie met de standaard whole cell opnametechnieken dit model systeem kan gebruikt worden om de rol genen en omgevingsfactoren betrokken zijn bij de ontwikkeling van elektrische prikkelbaarheid en synaptische transmissie (Hodges et al., 2002 verkennen;. Lee en O Dowd, 2000; Lee et al., 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.