Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

Summary

Это видео демонстрирует подготовки первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Просмотров живых культур показывают клетки через 1 час после покрытия и дифференцированных нейронов после 2 дней роста бикарбоната основе определенной среде. Нейроны являются электрически возбудимыми и формы синаптических связей.

Abstract

Это видео показывает, порядок внесения первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Методы сбора эмбрионов и их dechorionation использования отбеливателя демонстрируются. Использование стеклянной пипетки придает трубке всасывания рот, мы проиллюстрируем удаление всех клетках одного из эмбрионов. Метод диспергирования клетки от каждого embyro в небольшой (5 л) каплю среды на немелованной стекло покровное демонстрируется. Вид через микроскоп на 1 час после покрытия иллюстрирует предпочтительный плотность клеток. Большинство клеток, которые выживают при выращивании в определенной среде являются нейробластов, которые делят один или несколько раз в культуре, прежде чем предоставлять neuritic процессов 12-24 часов. Вид через микроскоп иллюстрирует уровень аксонов и ветвление ожидается в здоровую культуру в 2-х дней в лабораторных условиях. Культур выращивают в простой бикарбонат основан определенной среде, в 5% CO ₂ инкубаторе при 22-24 ° С. Neuritic процессов продолжать разрабатывать в течение первой недели в культуре и, когда они делают контакт с нейритов из соседних клетках они часто образуют функциональные синаптических связей. Нейроны в этих культурах выразить напряжения закрытого натрия, кальция и калия каналов и являются электрически возбудимыми. Эта культура система полезна для изучения молекулярно-генетических и экологических факторов, которые регулируют дифференциацию нейронов, возбудимость, и формирование синапса / функцию.

Protocol

И. дрозофилы эмбрионов коллекции

1. Подготовка пластин сбора яиц
   1. Отварите 200 мл дН ₂ O с 8 г агар
   2. Остудить до 50 ° C
   3. Добавить 2 мл этанола и 2 мл уксусной кислоты
   4. Налейте в 35 мм пластиковые чашки Петри, топы
   5. Охладить и хранить в воздухе трудный контейнер при температуре 4 ° C
   6. Делает около 80 пластин
2. Подготовка дрожжевой пасты
   1. Растворите Fleishmans активных выпечке дрожжи в воде с образованием пасты
   2. Микроволновые в течение 20-30 секунд, чтобы убить дрожжи (следите за кипит)
   3. Хранить в 10 мл шприца (без иглы) при 4 ° С в течение 2 недель
3. Мухи: взрослые используется для сбора яиц, как правило, наиболее продуктивным от 3 до 14 дней после выхода при условии, что они имели доступ к свежей пищи. Многие мутант запасы сократились рождаемость, которая может проявляться в пониженная ставка яйценоскость и изменение возраста, в котором они могут работать наиболее продуктивно. Как правило, несколько сотен взрослых делают для хорошей яйцекладки населения.
4. Процедура: Нанесите тонкий слой пасты на дрожжах пластины сбор яиц. Это обеспечивает благоприятный субстрат для укладки яиц. Передача взрослых мух в чистую бутылку сбор яиц и ленты коллекции плита в рот из бутылки. Не оставляйте мух в этих бутылках дольше, чем 3-4 часа, как влажность воздуха поднимается и мухи застревают в пасту и по бокам бутылки.

II. Эмбрион Dechorionation с Bleach

1. Настройка воронке Бюхнера связаны с фильтром колбе прилагается к аспиратора. Положите кусок ватмана № 1 бумагу в воронке. При всасывании работает, мокрой бумаги стерильной дистиллированной водой.
2. Промыть эмбрионы из коллекции пластин на фильтровальную бумагу с потоком воды от мытья бутылок.
3. Промойте их в нескольких томах стерильной воды, выключить аспиратор, а затем добавить воронку объемом 50% гипохлоритом натрия. Давайте яйца сидеть 5-10 минут. Chorions будет распущен в течение 1-2 минут, но чем дольше вы оставите эмбрионов в отбеливатель больше загрязняющих дрожжи будут уничтожены. Выберите какую-либо взрослых или личинки, которые смываются блюдо.
4. Промойте эмбрионы в стерильную чашку Петри (НЕ тканевая культура) стерильной дистиллированной водой. Многие из эмбрионов будут придерживаться дно тарелки, если он не был предварительно смачивается. Промойте несколько раз стерильной водой в этом блюде.
5. Изучить эмбрионов в проходящем свете, чтобы выбрать середине гаструлы эмбрионов стадии.

III. Подготовка одного эмбриона культур

1. Сделать DDM1 (см. рецепты в разделе IV)
2. Налейте воду с блюдом эмбрионов непосредственно перед культивирования. Обложка эмбрионов стерильными средствами массовой информации.
3. Изложить 3, 35 мм чашки Петри. Положите в 4 автоклавного круглые покровные в каждом блюде. На каждом покровное, положить 5 мкл среды. Используйте Bellco покровные низкой coverlips свинцового стекла.
   
   Bellco Биологические Стекло
   800-257-7043
   Cat # 1943-00012
   
   
4. Вытяните некоторые довольно тонкая пипец. Пипец мы используем, натянул Narishige PP-83 съемника. Точные размеры пипетки не решающее значение, и мы, как правило вытащить их тоньше, чем мы хотим, и разорвать их отзыв в одном поле зрения, как эмбрион, чтобы измерить размер. Вы же не хотите, чтобы высосать все из эмбрионов на одном дыхании, и ваши не хотят наконечник настолько мала, что она занимает 5 минут, чтобы поглощать клетки. Стремитесь к где-то посередине. Изучить эмбрионов в проходящем свете и использовать трубку рот всасывания придается пипетки, чтобы удалить содержимое эмбриона. Дисперсные клеток на подготовленные покровное, осторожно исключения клетки как можно ближе к покровным насколько это возможно. Вы можете хотеть рассмотреть покровные при более высокой мощности и дальнейшего разгона клеток в том же порядке.
5. Пусть клетках сидят на срок не более 10 минут. Потоп блюдо со средствами массовой информации и положить в инкубатор, 4-5% СО ₂ окружающей среды, при использовании определенной среде. Температура между 22-24 ° C. Мы обычно используют 23 ° С и 95% влажности. Влажность имеет важное значение, как вы хотите, чтобы избежать испарения. Вы можете использовать стандартные млекопитающих инкубаторе размещены в охлаждаемых помещений с контролем температуры установлен в 23 ° C.

IV. DDM1 определенной среде для выращивания культур

1. Сделать DMEM: К 100 мл F12/DME СМИ Хэма (DMEM) (Ирвин Научно # 9052).
   1. Добавить 0,476 г Hepes (20 мм) (Sigma # H-3375). Mix.
   2. Добавить 1,25 мл L-глютамин 200 мм (Ирвин Научно # 9317). Mix.
   3. Фильтр в капюшон с 0,2 мкм ацетата шприц фильтр (необходимо 2 фильтра).
   4. РН 6,64 и Osm 288.
   5. Сделать аликвоты 10 мл в 15 мл пробирки центрифуги.
   6. Хранить при температуре 4 ° С в течение не более 2 недель.
      
      Примечание: Всегда используйте автоклавного фильтрованную воду и сделать в контейнерах, которые зарезервированы для СМИ и дополнений только. Никогда не кладите рН электрод или мешалкой используются для других целей в Media.To сделать DDM1: Добавить добавки, перечисленные нижев DMEM незадолго до культивирования.
      
      
2. К 10 мл DMEM добавить:
   • 100 мкл трансферрина
   • 100 мкл путресцин
   • 100 мкл Селен
   • 100 мкл Прогестерон
   • 50 мкл инсулина

Discussion

В культурах Drosophila приготовленные из эмбрионов midgastrula этапе нейроны возникают из нейробластов предшественников, многие из которых делят до дифференциации в пробирке. Эта система обеспечивает, таким образом уникальные возможности для исследования генетических и экологических факторов, важных в очень ранней стадии развития нейронов (Rohrbaugh и соавт., 2003). Мы показали, что нейроны, выращенные в простой определенной среде дифференцироваться в электрически возбудимых нейронов, которые также формируют функциональные синаптических связей (О Дауд, 1995, Ли и О Дауд, 1999). Использование анализ мутантов и / или фармакологических манипуляций, в сочетании со стандартной целой клетки записи методы этой модели система может быть использована для изучения роли генов и экологических факторов, участвующих в развитии электрической возбудимости и синаптической передачи (Ходжес и др., 2002;. Ли и О Дауд, 2000, Ли и др., 2003)..

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma-Aldrich	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma-Aldrich	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma-Aldrich	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma-Aldrich	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma-Aldrich	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Glass	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman, GE Healthcare	#1
10cc syringe	Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.