Summary
Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme kaplama 2 gün sonra bir bikarbonat tabanlı tanımlı bir ortamda büyüme ve farklı nöronlar sonra hücreler 1 saat gösteriyor. Nöronların elektriksel olarak uyarılabilen ve sinaptik bağlantıları formu.
Abstract
Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin yapmak için prosedür göstermektedir. Çamaşır suyu kullanarak embriyo ve kendi dechorionation toplama yöntemleri gösterilmektedir. Ağız emme borusu bağlı bir damlalıklı cam kullanarak, tüm hücreleri tek embriyolar kaldırılması göstermektedir. Kaplamasız bir cam lamel, orta (5 lt) küçük bir düşüş içine her embyro hücrelerini dağıtma yöntemi olduğunu göstermiştir. Kaplama 1 saat sonra mikroskop ile bir görünüm için tercih edilen bir hücre yoğunluğu göstermektedir. Tanımlanan orta büyüdüğü zaman hayatta hücrelerinin çoğu 12-24 saat nöritik süreçleri uzanan önce bir kez veya daha fazla kültür bölmek neuroblasts. Mikroskop aracılığıyla bir görünüm neurite akıbet seviyesini gösterir ve in vitro 2 gün sağlıklı bir kültür beklenen dallanma. Kültürleri, 22-24 ° C'de% 5 CO 2 inkübatör tanımlanan orta tabanlı basit bir bikarbonat yetiştirilen Nöritik süreçleri kültürünün ilk haftasında ayrıntılı olarak devam etmek ve komşu hücrelerden genellikle fonksiyonel sinaptik bağlantıları formu neurites ile temas yaparken. Bu kültürlerin Nöronlar voltaj kapılı sodyum, kalsiyum ve potasyum kanalları ifade ve elektriksel olarak uyarılabilen. Bu kültür sistemi nöronal farklılaşma, heyecanlanma, ve sinaps oluşumu / fonksiyon düzenleyen moleküler genetik ve çevresel faktörlerin çalışmak için yararlıdır.
Protocol
I. Drosophila Embriyo Koleksiyonu
- Yumurta toplama plakaları hazırlayın
- 8 g agar ile kaynatın 200 ml dH 2 O
- Soğuk - 50 ° C
- 2 ml EtOH ve 2 ml asetik asit
- 35 mm plastik petri kaplarına, tops dökün
- Serin ve hava geçirmez bir kapta saklayın, 4 ° C
- Yaklaşık 80 plakalar yapar
- Maya macun hazırlayın
- Hamur oluşturmak için Fleishmans aktif pişirme maya su içinde çözülür
- Maya öldürmek için 20-30 saniye Mikro dalga fırın (Üzerine kaynar dikkat)
- 4 ° C için 2 hafta, 10 cc şırınga (iğne) saklayın
- Sinekler: yumurta toplama için kullanılan yetişkin taze gıda erişim vardı koşuluyla, genellikle 3 ile 14 gün arasında ortaya çıkan sonra en verimli. Birçok mutant stokları yumurtlama ve en verimli hangi yaşta bir değişiklik indirdi oranı kendini gösterir doğurganlık azalmıştır. Genellikle iyi bir yumurtlama nüfus için, birkaç yüz yetişkin olun.
- Prosedür: Bir yumurta toplama plakası yapıştırmak maya ince bir tabaka sürün. Bu yumurta döşenmesi için uygun bir substrat sağlar. Transferi yetişkin şişenin ağzına temiz bir yumurta toplama şişesi ve bant toplama plakası uçar. Nem oranı yükselir ve sinekler yapıştırın ve şişe tarafta takılıyorum 3-4 saatten daha uzun süre bu şişelerde sinekler terk etmeyin.
II. Çamaşır suyu ile Embriyo Dechorionation
- Bir aspiratör bağlı bir filtre balonuna bağlı bir Buchner huni ayarlayın. Huni whatman # 1 kağıt parçası koyun. Emme çalışırken, kağıt steril distile su ile ıslatın.
- Yıkama şişe su akışı ile filtre kağıdı üzerine toplama plakaları embriyolar durulayın.
- Steril su çeşitli hacimlerde onları durulayın, aspiratör kapatmak ve daha sonra bir huni hacminin% 50 çamaşır suyu ekleyin. Yumurtalar 5-10 dakika bekletin. Chorions 1-2 dakika içinde çözünmüş, ama uzun süre daha fazla kirlenmesine neden olan maya yok edilecektir çamaşır embriyolar terk olacaktır. Çanak durulanır herhangi bir yetişkin veya larva dışarı seçin.
- Steril distile su ile steril bir petri (doku kültürü DEĞİL) embriyolar durulayın. Önceden ıslatılmış edilmemiş ise embriyoların çoğu çanak alt sopa olacak. Bu yemeğin steril su ile birkaç kez durulayın.
- Gastrula orta dönem embriyoların almak için iletilen ışık ile embriyolar inceleyin.
III. Tek embriyo kültürlerin hazırlanması
- DDM1 (bölüm IV tarifleri görmek) gerçekleştirmek
- Hemen önce kültür embriyo çanak kapalı su dökün. Embriyolar steril ortam ile kaplayın.
- 3, 35 mm petri kaplarına ayarlayın. Her çanak 4 otoklavlanmış yuvarlak lamelleri koyun. Her lamel, 5 ul orta koydu. Bellco lamelleri düşük kurşun cam coverlips kullanın.
Bellco Biyolojik Züccaciye
800-257-7043
Kedi # 1.943-00.012 - Bazı oldukça ince pipetler çekin. Kullandığımız pipetleri bir Narishige PP-83 çektirmesi çekti. Pipetlemeyin kesin boyutları çok önemli değildir ve genellikle onları bizim istediğimiz daha ince çekin ve onları boyutunu ölçmek için embriyo olarak aynı alanda ucu kesiyorum. Tek seferde tüm embriyoların emmek istiyor ve bu hücrelerin emmek için 5 dakika sürer ucu kadar küçük istemiyorum. Arasında bir yere yöneltin. Iletilen ışık ile embriyoların inceleyin ve embriyo içeriğini kaldırmak için pipetlemeyin bağlı bir ağız emme borusu kullanmayın. Lamel mümkün olduğunca yakın olarak hücrelerin nazikçe atarak hazırlanan lamel üzerine hücreler dağılırlar. Lamelleri yüksek bir güç düzeyinde incelemek istediğiniz ve hücrelerin daha aynı şekilde dağıtmak.
- Hücreleri, 10 dakikadan daha uzun süre bekletin. Sel çanak medya ile ve inkübatör koymak,% 4-5 CO 2 ortamında tanımlanan orta kullanıyorsanız. Sıcaklık 22-24 arasında ° C Biz rutin olarak 23 ° C ve% 95 nem kullanın. Nem buharlaşmasını önlemek için istediğiniz gibi önemlidir. 23 ayarlanan sıcaklık kontrolü ile coldroom yerleştirilen standart bir memeli inkübatör ° C
IV. Kültürler büyüyen DDM1 Tanımlı orta
- 100 ml Ham F12/DME Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052): DMEM Yapın
- 0.476 g HEPES (20mm) (Sigma # H-3375). Karıştırın.
- 1.25 ml L-Glutamin 200 mM (# 9317 Irvine Scientific) ekleyin. Karıştırın.
- Filtre 0.2 mikron asetat şırınga filtresi (2 filtrelere ihtiyaç) ile kaputu.
- PH 6.64 ve OSM 288.
- 15ml santrifüj tüplerine 10 ml hacimde olun.
- 4 ° C en fazla 2 hafta saklayınız.
Not: Daima yalnızca medya ve Takviyeler için ayrılmış kaplarda otoklavlanmış filtrelenmiş su kullanımı ve. Aşağıda listelenen ekle takviyeleri: pH elektrodu koymak ya da Asla Media.To diğer amaçlar için kullanılan bar karıştırın DDM1 olunkültür için DMEM hemen önce.
- DMEM eklemek için 10 ml:
- 100 ul Transferrin
- 100 ul Putrescine
- 100 ul Selenyum
- 100 ul Progesteron
- 50 ul İnsülin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Midgastrula dönem embriyoların hazırlanan Drosophila kültürlerde nöronlar in vitro farklılaşma önce bölmek çoğu neuroblast öncüleri, ortaya çıkar. Bu sistem, böylece nöronal gelişiminin çok erken evrelerinde (Rohrbaugh ve ark, 2003) önemli genetik ve çevresel faktörlerin araştırılması için eşsiz bir fırsat sağlar. Biz, tanımlanmış basit bir ortamda yetişen nöronların elektriksel olarak uyarılabilen nöronların (Lee ve O Dowd, 1999 O Dowd, 1995) fonksiyonel sinaptik bağlantıları oluşturmak ayrım olduğunu göstermiştir. Bu model sistemi sinaptik iletim (Hodges ve ark, 2002 elektrik uyarılabilirlik ve geliştirme dahil rolü genler ve çevresel faktörler keşfetmek için kullanılabilir standart tüm hücre kayıt teknikleri ile birlikte, mutantlar ve / veya farmakolojik manipülasyonlar analizi kullanarak, Lee ve Ç Dowd, 2000; Lee ve ark, 2003)..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe NS27501 tarafından desteklenen DKOD. Bir HHMI Profesör Grant DKOD bu iş için ek destek.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
| Transferrin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml1.Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle2.Add 49 ml ddH2O3.Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O4.Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)5.Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
| DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks:100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine,100 ul Selenium,100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
| Petri dishes | ||||
| Cover-slips | Bellco Glass | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
| Paper filter | Whatman, GE Healthcare | #1 | ||
| 10cc syringe | Tool | |||
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media. |
||||
References
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce. J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).
- Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons. Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).
- Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons. J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).
