Summary
In dit rapport tonen we aan technieken die gebruikt kunnen worden om de biologie van de rivierkreeft einddarm te onderzoeken. We laten zien hoe je een rivierkreeft buik ontleden en bestuderen de bijbehorende anatomie, fysiologie en modulatie van de activiteit. De peristaltische activiteit en de sterkte van de contracties worden gemeten met behulp van een krachtopnemer.
Abstract
Het doel van het rapport is om dissectie technieken beschrijven voor de voorbereiding van de rivierkreeft einddarm en aan te tonen hoe de fysiologische opnames te maken met een krachtopnemer om de sterkte van de samentrekking te controleren. Daarnaast hebben we laten zien hoe je visueel peristaltische activiteit, die kan worden gebruikt als een bioassay voor de verschillende peptiden, biogene aminen en neurotransmitters te controleren. Dit preparaat is vatbaar voor student laboratoria in de fysiologie en voor het demonstreren van farmacologische concepten aan studenten. Dit preparaat is in gebruik voor meer dan 100 jaar, en het biedt nog steeds veel als een model voor het onderzoeken van de generatie en de regulering van peristaltische ritmes en voor het beschrijven van de mechanismen die ten grondslag liggen aan hun modulatie. De farmacologische assays en receptor sub-typen die werden meer dan 50 jaar geleden gestart op de einddarm nog bijdragen tot het onderzoek vandaag. Deze robuuste voorbereiding is zeer geschikt voor het trainen van studenten in de fysiologie en farmacologie.
Protocol
1. Introductie
De meest recente overzicht van de rivierkreeft einddarm is nageleefd in een proefschrift van dr. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), die primair gericht op het serotonerge modulatie en innervatie (Musolf et al.., 2009 ). Schaaldieren hindguts werden voor het eerst meer dan 100 jaar geleden onderzocht door Alexandrowicz, een pionier in de vergelijkende anatomie (Alexandrowicz, 1909), die beschreef de verschillende aspecten van hun innervatie. Onderzoek voortgezet door de jaren heen, het identificeren van de aard van de spierlagen en architectuur, het aanpakken van de algemene functie van de einddarm in osmoregulatie voor het hele dier, en het onderzoeken van modulerende controle van de einddarm contractiliteit door de verschillende verbindingen (zie recensie van Musolf, 2007). Het is interessant op te merken dat de anale gedeelte van de einddarm handelingen niet alleen om uitwerpselen te verdrijven, maar ook tot het nemen van het water uit de omgeving voor osmoregulatie. Deze regio van de darm kan naar voren ondergaan of achteruit peristaltiek afhankelijk van de behoeften van het dier.
Alexandrowicz (1909) constateerde dat er twee zenuwknopen innerveren het schaaldier einddarm, een innerlijke plexus en een buitenste plexus, die later bleek te rijke bronnen zijn voor het identificeren en karakteriseren van neurotransmitters. In de jaren 1950 dr. Ernst Florey begon met een reeks van farmacologische studies over de rivierkreeft einddarm en toonde aan dat contracties worden gemoduleerd door acetylcholine en de bijbehorende verbindingen en ook door epinefrine en norepinefrine (Florey, 1954). Florey, de ontdekker van een remmende stof bekend staat als "Factor-I," bestudeerde de effecten van deze stof op verschillende preparaten, met inbegrip van het GI-systeem in rivierkreeft (Florey, 1961). Factor-I werd later aangetoond dat GABA. Zo is de rivierkreeft einddarm een belangrijke rol gespeeld in de vroege studies van synaptische inhibitie.
Na de ontdekking van GABA, werden andere vermeende zenders ook aangetoond te worden geassocieerd met de einddarm plexus en fysiologische reacties uitlokken. Dergelijke zenders onder meer dopamine (Elekes et al., 1988;. Elofsson et al. 1968.), Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al. 1997) twee orcokinin peptiden (NFDEIDRSGFGFN en AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al. 1994;.. Dircksen et al., 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al. 2000.) en een myosuppressin peptide (Mercier et al., 1997;... waarschijnlijk pQDLDHVFLRFamide, zie Stemmler et al. 2007). Elk van deze stoffen moduleert spontane einddarm weeën, en alle met uitzondering van GABA blijken te zijn prikkelend. De einddarm voldoet ook aan glutamaat en quisqualate (Jones, 1962;. Verkeerde et al. 2003), maar duidelijk bewijs voor glutamaat innervatie is niet gemeld. Intracellulaire boodschappers dat de effecten van de verschillende zenders bemiddelen zijn grotendeels onontgonnen, maar er is bewijs voor de betrokkenheid van cAMP in het vermogen van dopamine om contracties (Knotz & Mercier, 1995) te verbeteren.
Hoewel de schaaldieren einddarm contracten spontaan na denervatie, zoals weeën zijn meestal zwak en ongeorganiseerd (Wales, 1982; Winlow & Laverack, 1972b). Peristaltische beweging vereist gecoördineerd motor output van het centrale zenuwstelsel, blijkbaar uit de laatste buik ganglion (Winlow & Laverack, 1972b, b, c). In rivierkreeft, is de motor uitgang vervoerd naar de einddarm door de 7 e buik wortel, die 75 axonen, waarvan cellichamen zijn gelokaliseerd in de laatste buik ganglion (Kondoh & Hisada, 1986) bevat. Tenminste een deel van de peptiden lijken te worden geleverd aan de einddarm plexus van de neuronen van oorsprong uit de laatste buik ganglion (Dircksen et al., 2000;.. Mercier et al., 1991b; Siwicki & Bishop, 1986), maar dopamine wordt geleverd door de neuronen in meer anterior ganglia (Mercier et al.. 1991a). Sinds motorvermogen via de 7 e buik wortel nodig is voor grote, gecoördineerde samentrekkingen, is het waarschijnlijk dat sommige of alle van de vermeende zenders hierboven genoemde bijdragen of andere manier aan peristaltiek. Hun relatieve bijdragen zijn echter niet bekend. Enig inzicht kan worden verkregen door het bestuderen van hun effecten op de circulaire en longitudinale spieren afzonderlijk (Mercier & Lee, 2002).
In aanvulling op de beweging van onverteerd voedsel, de zenuw plexus worden geassocieerd met het schaaldier einddarm lijkt te spelen een belangrijke endocriene functie in verband met de rui. De einddarm van de krab, Carcinus maenas, bevat endocriene cellen die schaaldieren hyperglycemische hormoon en de bijbehorende voorloper peptide afgifte tijdens ecdysis (Webster et al.. 2000), hetgeen duidt op een rol in de wateropname en de zwelling in verband met de rui. Zo, de schaaldieren einddarm neemt deel aan een aantal belangrijke fysiologische processen.
Dit rapport is in de eerste plaats een pedagogisch instrument voor geavanceerde high school en undergraduate studenten in de fysiologie cursussen die deelnemen aan experimenten. De betekenis en de mogelijke mechanisme achter hoe de einddarm contracten en functies kunnen worden aangepakt door de studenten. Farmacologische middelen, neurotransmitters en neurohormonen zal worden gebruikt, en de dosis-respons curves zullen worden gebouwd, die zullen de studenten in hoe het verwerven en interpreteren fysiologische en farmacologische gegevens in te schakelen. Een algemeen begrip van receptor functie ten aanzien van agonisten en antagonisten kan ook worden bereikt. De studenten zullen ook leren om gegevens te presenteren in grafische vorm voor statistische analyse.
Het is heel gemakkelijk te ontleden en de weeën op te nemen van de rivierkreeft einddarm. In de voorbereiding ontleed, is de darm makkelijk blootgesteld aan exogene stoffen. De wijziging in de peristaltische activiteit kan visueel of met een kracht transducer, die ook toezicht houden op de kracht van de contracties worden gecontroleerd. Door zijn eenvoud en betrouwbaarheid als een bioassay voorbereiding, de rivierkreeft einddarm is nog altijd zeer bruikbaar voor het onderzoeken van een groot aantal onderzoeksvragen over de mechanismen van de peristaltiek, modulatie van motorvermogen en het samentrekken van de spieren, en receptor functie. De einddarm is ook nuttig voor het testen van insecticiden, crustaceancides, en verontreinigende stoffen voor de specifieke mechanismen van acties.
2. Methoden
2.1) Materialen
- rivierkreeft
- rivierkreeft zoutoplossing
- dissectie instrumenten (grof en fijn schaar, grof en fijn pincet)
- Sylgard bodem petrischaal
- stalen pennen ontleden
- bekers (met chemische oplossingen houden)
- Parafilm (voor het afdekken en het mengen van oplossingen)
2.2) Dissection
- Rivierkreeft (Procambarus clarkii) het meten van 6-10 cm in lengte moet worden gelegd op ijs gedurende 5 tot 10 minuten om het dier te verdoven voordat dissectie begint.
- Houd de verdoofde kreeften van achter de klauwen met een hand. Snel, gesneden uit de oogkas naar het midden van de kop aan beide kanten, en vervolgens onthoofden van de rivierkreeft (Let op: het bloed van de voorbereiding zal worden kleverig als het droogt, dus de tools te wassen als ze klaar zijn).
Figuur 1: Onthoofding van rivierkreeftjes - Snijd de chelipeds en lopen de benen.
- Snijd het linker en rechter tailfins, alleen het verlaten van de middelste staartvin (uropod).
- Aan de dorsale zijde van de rivierkreeft gesneden ventraal op zowel de linker-en rechterzijde van de dorsale cuticula.
Figuur 2: Verwijdering van Dorsale Nagelriem - Snijd dwars op de dorsale zijde van de nagelriem, en zorg ervoor dat de snede is ondiep om schade aan de GI te voorkomen Verwijder vervolgens het onderste gedeelte van de rug-buik cuticula.
- Plaats de ontleed kreeften in een Sylgard beklede schaal.
- Speld de rivierkreeft om de schotel op het puntje van de staart. Men kan gebruik meer pinnen aan weerszijden van de GI als nodig is om het lichaam te ingedrukt te houden.
- Vul de schaal met rivierkreeftjes zoutoplossing die de GI Zorg ervoor dat de GI voortdurend blussen met een zoutoplossing met een pipet. Saline is een gemodificeerde van Van Harreveld-oplossing (1936), die is gemaakt met 205 mM NaCl, 5,3 mM KCl; 13,5 mM CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES en aangepast aan de pH 7,4. De ontleed rivierkreeft moeten verschijnen zoals getoond in figuur 3.
Figuur 3: ontleedde rivierkreeftjes met een geografische aanduiding intact.
2.3) Experimenten
2.3.1) contracties in het dier
- Hebben oplossingen van de verbinding te testen klaar zijn en op dezelfde temperatuur als de baden zoutoplossing. Op zou kunnen gebruiken individuele oplossingen van serotonine (100 nM, 1microM), glutamaat (1microM) en dopamine (1microM) gemaakt in rivierkreeft zoutoplossing als uitgangsstoffen te worden getest.
- Laat de ontleed rivierkreeft in de rivierkreeft oplossing zitten voor ongeveer tien minuten om deze aan te passen aan de schok van dissectie en zout blootstelling. De trage peristaltiek contracties van de einddarm zou moeten beginnen voor te komen.
- Zodra de weeën beginnen, registreren het aantal contracties die zich voordoen in dertig seconden (let op de aard van de weeën die zich voordoen: dat wil zeggen peristaltiek type, of spastische, en de richting van een peristaltische golven).
Tabel 1: Weeën in Rivierkreeftjes SalineAantal contracties Aard van de contracties - Met behulp van een piPette, verwijder de zoutoplossing in de holte van de blootgestelde de rivierkreeft de buik, en toe te passen zoutoplossing die de stof direct worden onderzocht op de einddarm.
- Onmiddellijk na het toevoegen van de oplossing, registreren het aantal contracties die na dertig seconden en noteer de aard van de contracties die zich voordoen (bijv. peristaltische, of spastische).
Tabel 2: contracties met de blootstelling aan stoffenCompound getest Concentratie Aantal contracties Aard van de contracties - Onmiddellijk na de opname de reactie op de teststof, spoel de GI meerdere malen met een normale rivierkreeftjes zoutoplossing. Laat de voorbereiding van 5 minuten staan, tijdens het spoelen ongeveer elke 30 seconden met rivierkreeftjes zoutoplossing.
- Met behulp van een pipet, plaats een zoutoplossing die de volgende verbinding die moet worden onderzocht of een gevarieerd concentratie van de laatste stof getest direct op de einddarm. Het is het beste om te beginnen met een lagere concentratie en werk een weg naar hogere concentraties.
- Onmiddellijk na het toevoegen van elke nieuwe stof of elke nieuwe concentratie, registreren het aantal contracties die na dertig seconden en noteer de aard van de contracties.
2.3.2) opnemen krachten van de krimp in weggesneden voorbereidingen
Figuur 4: Setup
- Bevestig de transducer naar de brug pod.
- Bevestig de brug pod aan de PowerLab 26T.
- Bevestig de PowerLab 26T aan op de USB-poort op de computer.
- Open LabChart7, door te klikken op de labchart7 pictogram op het bureaublad.
- De LabChart Welcome Center box zal verschijnen geopend. Sluiten.
- Klik op Setup
- Klik op kanaal instellingen. Verander het aantal kanalen op 1 (links onder in box) druk op OK.
- Op de linkerbovenhoek van de grafiek die de cycli per seconde tot ongeveer 2k. Stel de volt (y-as) tot ongeveer 500 of 200 mV.
- Klik op Channel 1 aan de rechterkant van de grafiek. Klik op Input versterker. Zorg ervoor dat de instellingen: single-ended, ac gekoppeld, en omgekeerd (keert het signaal indien nodig), en anti-alias, worden gecontroleerd.
- Om de opname te druk op start te beginnen.
- Pak de voorbereiding en snijd het spijsverteringskanaal op het verbindingspunt tussen de borstkas en de buik. Dan voorzichtig snij je rond de telson deel van de staart. Verwijder het darmkanaal van de ontleed rivierkreeft en plaats deze in de Sylgard schotel. Er is een bloedvat dat loopt langs de dorsale aspect van het maag-darmkanaal. Voorzichtig trek deze uit het spijsverteringskanaal. Giet verse kreeft zout op de voorbereiding.
- Plaats de krachtopnemer in de klem bij de ontleed rivierkreeft.
- Haak de krachtopnemer in de rivierkreeft GI zoals weergegeven in figuur 5.
Figuur 5: Geïsoleerde einddarm van de rivierkreeft in zoutoplossing aan de haak van de krachtopnemer - Wacht tot de GI begint te contracteren, en duw start op de LabChart7.
- Laat het programma te gebruiken voor ongeveer 20 seconden. Druk op "stop," en voeg het label een reactie, "Saline alleen". Vul de tabel 4.
Tabel 4: contracties met verbinding van belangAantal contracties Amplitude van de contracties (mV) - Voeg de test verbindingen van belang, en onmiddellijk druk op "start" op de LabChart7.
- Laat het programma te gebruiken voor ongeveer 20 seconden. Druk op "stop" en voeg een commentaar direct op de kaart bestand als wat stof was toegevoegd en de concentratie. Vul de onderstaande tabel.
Tabel 5: contracties met _________ compoundAantal contracties Amplitude van de contracties (mV) - Spoel de voorbereiding met rivierkreeftjes zoutoplossing met behulp van een pipet.
- Voeg andere stoffen of verscheidene concentraties op een vergelijkbare manier. Onmiddellijk druk op "start" op de LabChart7.
- Laat het programma te gebruiken voor ongeveer 20 seconden. Druk op "stop" en een opmerking toevoegen en label direct op de kaart met vermelding van het bestand compound gebruikt en de concentratie.
3. Data Analysis
- Van 2.3.1 van het experiment, grafiek is het aantal contracties van elke oplossing (zoutoplossing, serotonine, glutamaat) vs tijd. Verklaar eventuele trends.
- Van 2.3.2 van het experiment, grafiek is het aantal contracties van elke oplossing (zoutoplossing, serotonine, glutamaat) versus de amplitude van de contracties in mV. Verklaar eventuele trends.
3.1) Het meten van de snelheid en de kracht van de contracties
Het indexeren van de tarieven van de weeën op kan meten de tijd vanaf het begin op een afbuiging naar het begin van het volgende of tellen de totale vervorming meer dan een minuut of twee. De waarden kunnen dan worden gesteld in termen van contracties per minuut of per seconde, afhankelijk van hoe snel ze zich voordoen.
Het indexeren van de kracht van de contracties een relatieve maatstaf kan worden gebruikt om verschillende omstandigheden te vergelijken. Op het opgeslagen bestand kan men gebruik maken van de marker "M" en ga naar de basislijn. Gebruik vervolgens de cursor en ga naar de top van de doorbuiging en nemen nota van de waarde vermeld op de rechterbovenhoek van het scherm als een delta waarde (het verschil van M tot de top). Let op de cursor moet blijven stationair voor de maatregel van de verandering. Ga dan naar de M om de volgende golf vorm van rente en herhaal de maatregel.
Discussion
De gegevens die in de bijbehorende film en de tekst beschrijven de belangrijkste stappen die nodig zijn om de activiteit in de einddarm van de rivierkreeft record in situ als in vitro. Een doel van ons verslag is om het bewustzijn te verhogen om het potentieel van dit preparaat in de student-run onderzoeks laboratoria die fundamentele concepten in de fysiologie en farmacologie te onderwijzen.
Deze preparaten kunnen worden gebruikt om een aantal experimentele vragen die zal leiden tot een beter begrip van de fysiologische functies van de einddarm te onderzoeken. De mechanismen die ten grondslag liggen regulering van de peristaltische golven en hun omkering zijn nog niet bekend. De mechanismen voor een betere controle van het gehele maagdarmkanaal zijn ook niet volledig begrepen. De vraag hoe een hogere centra hun activiteiten te integreren met het autonome uitgang die direct stuurt het GI-systeem blijft een open gebied van onderzoek (Shuranova et al., 2006).. Bovendien hebben de osmoseregulerende mogelijkheden van de schaaldieren einddarm en de functies van osmoregulatie tijdens rui-en belasting van het milieu niet volledig opgehelderd. Er zijn nog veel vragen te wachten antwoorden in deze voorbereiding.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ondersteund door de Universiteit van Kentucky, Departement Biologie, Bureau van Undergraduate Studies en College of Arts & Sciences.
Materials
|
References
- Alexandrowicz, J. S. Zur Kenntnis des sympathischen Nervensystems der Crustaceae. Jena Z. Naturw. 45, 395-444 (1909).
- Bungart, D., Dircksen, H., Keller, R. Quantitative determination and distribution of the myotropic neuropeptide orcokinin in the nervous system of astacidean crustaceans. Peptides. 15, 393-400 (1994).
- Dircksen, H., Burdzik, S., Sauter, A., Keller, R. Two orcokinins and the novel octapeptide orcomyotropin in the hindgut of the crayfish Orconectes limosus: identified myostimulatory neuropeptides originating totether in neurons of the terminal abdominal ganglion. J. Exp. Biol. 203, 2807-2818 (2000).
- Elekes, K., Florey, E., Cahil, M. A., Hoeger, U., Geffard, M. Morphology, synaptic connections and neurotransmitters of the efferent neurons of the crayfish hindgut. Neurobiology of Invertebrates. Salanki, J., Rosza, K. 36, Akademiai Kiado. Budapest. 129-146 (1988).
- Elofsson, R., Kauri, T., Nielsen, S. O., Stroemberg, J. O. Catecholamine-containing nerve fibres in the hindgut of the crayfish Astacus astacus L. Experentia. 24, 1159-1160 (1968).
- Florey, E. Uber die wirkung von acetylcholin, adrenalin, nor-adrenalin, faktor I und anderen substanzen auf den isolierten enddarm des flusskrebses Cambarus clarkii Girard. Z. Vergl. Physiol. 36, 1-8 (1954).
- Florey, E. A new test preparation for bio-assay of Factor I and gamma-aminobutyric acid. J. Physiol. 156, 1-7 (1961).
- Jones, H. C. The action of L-glutamic acid and of structurally related compounds on the hind gut of the crayfish. J. Physiol. (London). 164, 295-300 (1962).
- Knotz, S., Mercier, A. J. cAMP mediates dopamine-evoked hindgut contractions in the crayfish, Procambarus clarkii. Comp. Biochem. Physiol. 111A, 59-64 (1995).
- Kondoh, Y., Hisada, M. Neuroanatomy of the terminal (sixth abdominal) ganglion of the crayfish, Procambarus clarkii. Cell. Tiss. Res. 243, 273-288 (1986).
- Mercier, A. J., Lange, A. B., TeBrugge, V., Orchard, I. Evidence for proctolin-like and FMRFamide-like neuropeptides associated with the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 75, 1208-1225 (1997).
- Mercier, A. J., Lee, J. Differential effects of neuropeptides on circular and longitudinal muscles of the crayfish hindgut. Peptides. 23, 1751-1757 (2002).
- Mercier, A. J., Orchard, I., Schmoeckel, A. Catecholaminergic neurons supplying the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 69, 2778-2785 (1991).
- Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V. FMRFamide-like immunoreactivity in the crayfish nervous system. J. exp. Biol. 156, 519-538 (1991).
- Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V., Skerrett, M. Isolation of two FMRFamide-related peptides from crayfish pericardial organs. Peptides. 14, 137-143 (1993).
- Musolf, B. E. Serotonergic modulation of the crayfish hindgut: Effects on hindgut contractility and regulation of serotonin on hindgut. Biol Bull. , Georgia State University. (2007).
- Musolf, B. E., Spitzer, N., Antonsen, B. L., Edwards, D. H. Serotonergic modulation of crayfish hindgut. Biol Bull. 217(1), 50-64 (2009). Biol Bull. 217, 50-64 (2009).
- Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Cooper, R. L. A hundred years ago and now: A short essay on the study of the crustacean hindgut. (Vor hundert Jahren und nun: Eine kurze Geschichte von die Forschung des Hinterdarmes der Crustaceen. Crustaceana. 76, 755-670 (2003).
- Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Strawn, J. R., Cooper, R. L. Evidence for an Autonomic Nervous System in Decapod Crustaceans. International Journal of Zoological Research. 2 (3), 242-283 (2006).
- Siwicki, K. K., Bishop, C. A. Mapping of proctolinlike immunoreactivity in the nervsou systems of lobster and. 243, 435-435 (1986).
- Stemmler, E. A., Cashman, C. R., Messinger, D. I., Gardner, N. P., Dickinson, P. S., Christie, A. D. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Sandeman, D. C., Atwood, H. L. Control of mouthparts and gut. The Biology of Crustacea. 4, Academic Press Inc. London. 165-191 (1982).
- Webster, S. G., Dircksen, H., Chung, J. S. Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide. J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity. Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output. Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies. Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).
- Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut. J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).
