ניסויים פיזיולוגיים עם במעי האחורי סרטן הנהרות: תרגיל מעבדה סטודנטים

Summary

בדו"ח זה אנו מדגימים טכניקות שיכולות לשמש כדי לחקור את הביולוגיה של סרטנים במעי האחורי. אנו מראים כיצד לנתח בטן סרטנים ותחקור את קשורה, פיזיולוגיה מודולציה של פעילות. פעילות כוח peristaltic של התכווצויות נמדדים באמצעות מתמר כוח.

Abstract

מטרת הדו"ח היא לתאר את טכניקות לנתיחה להכנת במעי האחורי סרטנים וכדי להדגים כיצד לבצע הקלטות פיזיולוגיים עם מתמר כוח לפקח על עוצמת ההתכווצות. בנוסף, אנו מדגימים כיצד חזותית לעקוב אחר פעילות peristaltic, אשר יכול לשמש עבור המבדק פפטידים שונים, אמינים ביוגניים ונוירוטרנסמיטרים. הכנה זו ניתנת במעבדות סטודנט בפיזיולוגיה עבור הוכחת מושגים תרופתי לסטודנטים. הכנה זו כבר בשימוש במשך 100 שנים, והיא עדיין מציעה הרבה כמודל לחקר הדור ורגולציה של מקצבים peristaltic ואת לתיאור המנגנונים אפנון שלהם. מבחני תרופתי ו הקולטן משנה הקלדת כי נפתחו מעל 50 שנים על במעי האחורי עדיין לתרום למחקר היום. הכנה זו חזקים מתאים גם לסטודנטים הכשרה בפיזיולוגיה ופרמקולוגיה.

Protocol

1. הקדמה

סקירה מקיפה האחרונה של סרטנים במעי האחורי היה נענה על עבודת הדוקטורט של ד"ר ברברה E. Musolf (2007, ג'ורג'יה סטייט, אטלנטה, ג'ורג'יה, ארה"ב), אשר התמקדו בעיקר אפנון העצבוב serotonergic ו (Musolf et al. 2009 ). Hindguts סרטנאים נחקרו הראשון מעל 100 שנים על ידי אלכסנדרוביץ', חלוץ אנטומיה השוואתית (אלכסנדרוביץ', 1909), שתיאר את ההיבטים השונים של העצבוב שלהם. המחקר נמשך לאורך השנים, לזהות את סוגי שכבות שרירים אדריכלות, פונה הפונקציה הכוללת של במעי האחורי של osmoregulation עבור החיה כולה, ובחינת השליטה modulatory של contractility במעי האחורי על ידי תרכובות שונות (ראו סקירה על ידי Musolf, 2007). מעניין לציין כי חלק אנאלי במעי האחורי של מעשים ולא רק לגרש צואה, אלא גם לקחת את המים מהסביבה עבור osmoregulation. זה האזור של המעיים יכול לעבור קדימה או לאחור תנועה פריסטלטית בהתאם לצרכים של בעלי חיים.

אלכסנדרוביץ' (1909) זיהה שני plexuses עצב innervating במעי האחורי סרטנאים, מקלעת פנימית מקלעת החיצונית, אשר מאוחר יותר התבררה מקורות עשירים לזיהוי ואפיון נוירוטרנסמיטורים. ב -1950 ד"ר ארנסט Florey החלה סדרה של מחקרים פרמקולוגיים על במעי האחורי סרטנים והוכיח כי הצירים הם מווסתת על ידי אצטילכולין ותרכובות הקשורות אליו וכן על ידי אפינפרין ונוראפינפרין (Florey, 1954). Florey, מגלה חומר מעכבות המכונה "Factor-I", חקר את השפעת החומר הזה על הכנות שונות, לרבות מערכת העיכול של סרטנים (Florey, 1961). פקטור, הראו לי מאוחר יותר להיות GABA. לכן, שיחק את במעי האחורי סרטנים תפקיד חשוב המחקרים המוקדמים של עיכוב סינפטי.

בעקבות גילויו של GABA, משדרי המשוערת אחרים הוצגו גם להיות מזוהה עם plexuses במעי האחורי כדי לעורר תגובה פיזיולוגית. משדרים אלה כוללות דופמין (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. מרסייה et al 1997) שני פפטידים orcokinin (NFDEIDRSGFGFN ו AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000). ו פפטיד myosuppressin (מרסיה et al 1997,... pQDLDHVFLRFamide סביר ביותר, השווה Stemmler et al 2007). כל החומרים האלה מודולציה התכווצויות במעי האחורי ספונטנית, וכל פרט GABA להיראות מעוררים. במעי האחורי גם מגיב גלוטמט quisqualate (ג'ונס, 1962;. Wrong et al 2003), אך הוכחה ברורה העצבוב glutamatergic לא דווחה. שליחים תאיים כי לתווך את ההשפעות של משדרי שונים נחקרו במידה רבה, אבל יש ראיות למעורבות של מחנה ביכולתה של דופמין כדי לשפר את התכווצויות (Knotz & מרסיה, 1995).

למרות במעי האחורי סרטנאים חוזים ספונטני הבאים denervation, התכווצויות כאלה הם בדרך כלל חלשים ולא מאורגנים (וויילס, 1982; Winlow & Laverack, 1972a). התנועה דורשת peristaltic פלט מנוע מתואמת של מערכת העצבים המרכזית, ככל הנראה שמקורם הגנגליון הבטן האחרון (Winlow & Laverack, 1972a, b, c). ב סרטנים, תפוקת המנוע מתבצע על במעי האחורי באמצעות השורש בטן 7 ^ה, אשר מכיל 75 אקסונים אשר תא גופים מקומי הגנגליון הבטן האחרון (Kondoh & Hisada, 1986). לפחות חלק פפטידים להיראות שסופקו מקלעת במעי האחורי מתא עצב שמקורם הגנגליון הבטן האחרון (Dircksen et al 2000;.. מרסייה et al 1991b; Siwicki & בישופ, 1986), אבל דופמין מסופק על ידי נוירונים יותר הגרעינים קדמית (מרסיה et al. 1991a). מאז תפוקת המנוע דרך השורש בטן 7 ^ה הכרחי, התכווצויות מתואמת גדול, סביר להניח כי חלק או את כל משדרי המשוערת המפורטים לעיל לתרום בדרך כלשהי תנועה פריסטלטית. התרומה היחסית שלהם, לעומת זאת, אינם ידועים. תובנה מסוימים עשויים להיות שנרכשו על ידי לימוד השפעתם על שרירים עגולים האורך בנפרד (מרסיה & Lee, 2002).

בנוסף שליטה על התנועה של מזון לא מעוכל, מקלעת העצבים הקשורים לסרטן במעי האחורי מופיעה לשחק תפקיד חשוב האנדוקרינית הקשורה השרה. במעי האחורי של הסרטן, Carcinus maenas, מכיל תאים אנדוקריני כי שחרור ההורמון סרטנאים hyperglycemic ו פפטיד מבשר הקשורות אליה במהלך ecdysis (וובסטר et al. 2000), דבר המצביע על תפקיד ספיגת מים ונפיחות הקשורים השרה. לכן, במעי האחורי סרטנאים משתתף מספר תהליכים פיזיולוגיים חשובים.

דו"ח זה הוא בעיקר כלי הוראה בתיכון מתקדמים סטודנטים בקורסים פיזיולוגיה המשתתפים בניסויים. המשמעות, כמו גם את מנגנון פוטנציאל מאחורי כיצד חוזים במעי האחורי פונקציות ניתן לטפל על ידי התלמידים. סוכני תרופתי, נוירוטרנסמיטורים, ו neurohormones ישמש, ועל מנה תגובה עקומות יוקם, אשר יעסקו התלמידים כיצד לרכוש לפרש נתונים פיזיולוגיים תרופתי. הבנה כללית של תפקוד הקולטן לגבי אגוניסטים ואת היריבים יכול גם להיות מושגת. הסטודנטים ילמדו גם להציג נתונים בצורה גרפית לניתוח סטטיסטי.

זה קל מאוד לנתח ולתעד התכווצויות במעי האחורי של סרטנים. בהכנת גזור, בטן חשופה בקלות לחומרים חיצוניים. שינוי בפעילות peristaltic ניתן לפקח באופן חזותי או עם מתמר כוח, אשר יכול גם לפקח על כוח של התכווצויות. בגלל הפשטות והאמינות כהכנה המבדק, סרטנים במעי האחורי הוא עדיין מאוד שימושי לחקר שאלות מחקר רבות על מנגנוני תנועה פריסטלטית, אפנון של תפוקת המנוע התכווצות שרירים, תפקוד הקולטן. במעי האחורי הוא גם שימושי עבור בדיקות חומרי הדברה, crustaceancides, ומזהמים עבור מנגנונים מסוים של פעולות.

2. שיטות

2.1) חומרים

• לנגוסטין
• סרטנים מלוחים
• דיסקציה מכשירים (מספריים גס & בסדר, גס & מלקחיים בסדר)
• Sylgard בעל תחתית צלחת פטרי
• סיכות פלדה לנתח
• כוסות (להחזיק תמיסות כימיות)
• parafilm (לכיסוי & ערבוב פתרונות)

2.2) Dissection

1. סרטן הנהרות (Procambarus כלארקיי) מדידה 6-10 ס"מ אורך הגוף צריך להיות ממוקם על הקרח במשך 5 עד 10 דקות כדי להרדים את החיה לפני לנתיחה מתחיל.
2. החזק את סרטנים הרדים מאחור ציפורניים ביד אחת. במהירות, לחתוך מתוך ארובת העין לאמצע הראש משני הצדדים, ולאחר מכן לערוף את סרטנים (הערה: את הדם הכנה יהיה דביק כאשר הוא מתייבש, אז לשטוף את הכלים כאשר הושלם).
   
   איור 1: עריפת ראש של סרטנים
3. לנתק את chelipeds והרגליים הליכה.
4. לנתק את tailfins על ימין ועל שמאל, רק עוזב את הסנפיר האמצעי (uropod).
5. בצד הגב של סרטנים לחתוך ventrally בצד שמאל וימין של לציפורן הגבי.
   
   איור 2: הסרת לציפורן הגבי
6. גזור רוחבי בצד הגבי של לציפורן, ולוודא כי הוא חתך רדוד כדי למנוע נזק העיכול ואז להסיר את החלק התחתון של הבטן לציפורן הגבי.
7. מניחים את סרטנים גזור לתוך צלחת Sylgard מרופד.
8. פין סרטנים כדי בצלחת בקצה הסנפיר. ניתן להשתמש בפינים יותר משני צדי העיכול ככל שיידרש כדי להחזיק את הגוף כלפי מטה.
9. מלאו את הצלחת עם מכסה מלוחים סרטנים במערכת העיכול הקפידו לכבות את הרף עם GI מלוחים באמצעות פיפטה. מלוחים הוא פתרון שונה של ואן Harreveld (1936), אשר הוא עשה עם 205 mM NaCl, KCl mM 5.3; 13.5 mM CaCl ₂ 2H ₂ O, 2.45 mM MgCl ₂ 6 שעות ₂ O; 5 HEPES מ"מ מותאם pH 7.4. סרטנים גזור אמור להופיע כפי שמוצג באיור 3.
   
   איור 3: גזור עם סרטנים במערכת העיכול ללא פגע.

2.3) ניסויים

2.3.1) צירים החיה

1. האם פתרונות של המתחם להיבדק מוכן בטמפרטורה זהה מלוחים הרחצה. ביום עשויים להשתמש פתרונות בודדים של סרוטונין (100 ננומטר, 1microM), גלוטמט (1microM) ודופאמין (1microM) שנעשו מלוחים סרטנים כמו חומרים החל להיבדק.
2. אפשר סרטנים גזור לשבת בפתרון לנגוסטין למשך כעשר דקות כדי לאפשר לו להסתגל ההלם של דיסקציה וחשיפה מלוחים. ההתכווצויות תנועה פריסטלטית איטי במעי האחורי צריך להתחיל להתרחש.
3. לאחר הצירים מתחילים, להקליט את מספר הצירים המתרחשות תוך שלושים שניות (שימו לב סוג של התכווצויות המתרחשות: סוג כלומר תנועה פריסטלטית, או ספסטית, ואת הכיוון של כל גלי peristaltic).
   טבלה 1: צירים סרטן הנהרות מלוחים
   

   מספר הצירים	סוג של התכווצויות

4. שימוש pipette, להסיר את מלח בתוך חלל הבטן חשוף של סרטנים, ולהחיל מלוחים המכיל את החומר כדי להיבחן ישירות על גבי במעי האחורי.
5. מייד לאחר הוספת פתרון, לרשום את מספר התכווצויות המתרחשות לאחר שלושים שניות ורשום את סוג של התכווצויות המתרחשות (כלומר peristaltic, או ספסטית).
   טבלה 2: התכווצויות עם חשיפה תרכובות
   

   מתחם נבדק	ריכוז	מספר הצירים	סוג של התכווצויות

6. מיד לאחר ההקלטה בתגובה חומר הבדיקה, לשטוף מספר פעמים עם GI מלוחים סרטנים נורמלי. בואו הכנת לעמוד במשך 5 דקות, תוך שטיפה על כל 30 שניות עם מלוחים סרטנים.
7. בעזרת פיפטה, מקום קצת מלחים המכילים את תרכובת הבא כדי להיבחן או ריכוז ומגוון של חומר האחרון נבדק ישירות על גבי במעי האחורי. עדיף להתחיל עם ריכוז נמוך יותר בדרך זו של עבודה ריכוזים גבוהים יותר.
8. מייד לאחר הוספת כל חומר חדש או כל ריכוז חדש, להקליט את מספר הצירים המתרחשות לאחר שלושים שניות ורשום את סוג של התכווצויות.

2.3.2) כוחות הקלטה של ​​התכווצות בהכנות נכרת

איור 4: התקנת

1. הצמד את המתמר אל הלהקה את הגשר.
2. צרף את תרמיל גשר 26T PowerLab.
3. צרף את 26T PowerLab ליציאת ה-USB במחשב.
4. פתח LabChart7, על ידי לחיצה על סמל labchart7 על שולחן העבודה.
   • תיבת ברוך LabChart מרכז יופיע פתוח. סגור אותו.
   • לחץ על הגדרת
   • לחץ על הגדרות הערוץ. שינוי מספר ערוצים 1 (השמאלית התחתונה של תיבת) לדחוף אישור.
   • בפינה השמאלית העליונה של התרשים להגדיר את מחזורים בשנייה כ 2k. הגדר את וולט (ציר y) כדי mV על 500 או 200.
   • לחץ על ערוץ 1 בצד ימין של התרשים. לחץ על מגבר קלט. ודא שהגדרות: single-ended, ac יחד, וגם להפוך (הופך את האות אם יש צורך), אנטי כינוי, נבדקות.
   • כדי להתחיל לחץ להתחיל בהקלטה.
5. תרימי את הכנה לחתוך את מערכת העיכול בצומת שבין החזה והבטן. ואז לחתוך בזהירות סביב החלק telson הזנב. הסר את מערכת העיכול של סרטנים גזור ומקום אותו לתוך התבשיל Sylgard. יש כלי דם שזורם לאורך בהיבט הגבי של מערכת העיכול. משוך בזהירות זה הרחק במערכת העיכול. יוצקים מלוחים סרטנים טריים על ההכנה.
6. מניחים את מתמר כוח מהדק הקרוב סרטנים גזור.
7. הוק מתמר כוח העיכול סרטנים כפי שמוצג באיור 5.
   
   איור 5: במעי האחורי בודדות של סרטנים של מלוחים המחובר הקרס של מתמר כוח
8. המתן עד העיכול מתחיל להתכווץ, ולדחוף להתחיל על LabChart7.
9. תנו את התוכנית לרוץ על 20 שניות. Push "לעצור", ולהוסיף תגובה שכותרתה, "מלוחים בלבד". מלא את טבלה 4.
   טבלה 4: התכווצויות עם תרכובת של עניין
   

   מספר הצירים	Amplitude של התכווצויות (mV)

10. מוסיפים את תרכובות המבחן של עניין, ומיד לדחוף "התחל" על LabChart7.
11. תנו את התוכנית לרוץ על 20 שניות. Push "עצור" והוסיפו תגובה ישירות על קובץ התרשים על מה חומר נוסף ואת הריכוז שלו. מלא את הטבלה להלן.
    טבלה 5: התכווצויות עם תרכובת _________
    

    מספר הצירים	Amplitude של התכווצויות (mV)

12. יש לשטוף את ההכנה עם מלוחים סרטנים באמצעות פיפטה.
13. הוספת חומרים אחרים או ריכוזים שונים באופן דומה. מיד לדחוף "התחל" על LabChart7.
14. תנו את התוכנית לרוץ על 20 שניות. Push "להפסיק", וגם להוסיף הערה ואת התווית ישירות על קובץ התרשים המציין את גompound משומשים הריכוז.

3. ניתוח נתונים

1. מ 2.3.1 של הניסוי, גרף את מספר הצירים של כל פתרון (סרוטונין מלוחים, גלוטמט) לעומת הזמן. הסבירו כל המגמות.
2. מ 2.3.2 של הניסוי, גרף את מספר הצירים של כל פתרון (מלוחים, סרוטונין, גלוטמט) לעומת משרעת של צירים mV. הסבירו כל המגמות.

3.1) מדידת קצב ועוצמת ההתכווצויות

מדד מחירים של התכווצויות ב יכולים למדוד את הזמן מההתחלה על סטיה אחת בתחילת הבא או לספור את deflections מלאה על דקה או שתיים. ערכים לאחר מכן ניתן לשים במונחים של התכווצויות לדקה או לשנייה, תלוי כמה מהירה הם מתרחשים.

מדד הכוח של התכווצויות למדוד יחסי יכול לשמש כדי להשוות תנאים שונים. על הקובץ שנשמר אפשר להשתמש בסמן "M" ולעבור הבסיס. לאחר מכן השתמש הסמן ולעבור השיא של סטיה ושימו לב לערך הרשום בפינה הימנית העליונה של המסך כערך הדלתא (ההפרש בין M לפסגה). הערה הסמן צריך להיות כל הזמן נייח עבור למדוד את השינוי. ואז להעביר את M כדי ליצור את הגל הבא של עניין לחזור על המידה.

Discussion

הפרטים הניתנים בסרט הקשורים הטקסט מתאר את השלבים העיקריים הדרושים כדי להקליט את הפעילות במעי האחורי של סרטנים באתרו וכן במבחנה. אחת ממטרות הדו"ח שלנו היא להגדיל את המודעות לפוטנציאל של הכנה זה סטודנט וברח מעבדות החקירה כי ללמד מושגי יסוד בפיזיולוגיה ופרמקולוגיה.

תכשירים אלה יכולים לשמש כדי לחקור מספר שאלות ניסיוניות אשר יובילו להבנה טובה יותר של הפונקציות הפיזיולוגיות של במעי האחורי. המנגנונים שבבסיס תקנה של גלי peristaltic ואת ההיפוך שלהם עדיין לא ידוע. מנגנוני שליטה גבוהה יותר של מערכת העיכול כולה הם גם לא הבינו באופן מלא. השאלה איך מרכזים גבוהים יותר לשלב את פעילותם עם הפלט ישירות האוטונומית שולטת על מערכת העיכול נשאר בשטח פתוח החקירה (Shuranova et al. 2006). בנוסף, יכולות osmoregulatory של סרטנאים במעי האחורי ואת הפונקציות של osmoregulation במהלך הלחץ השרה וסביבתיים טרם הובהר במלואו. יש עדיין שאלות רבות ממתינה לתשובות בהכנה זו.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard-bottomed Petri dish Beakers (to hold chemical solutions) Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Bridge pod for the force transducer (different Bridge pods are required for different types of force transducers). MLT0402 (2 grams) force transducer is the research grade as shown in the video. MLT 0210/D (10 mg-25 grams) and the MLT 500/A (0-500g) are the educational grades transducers (ADInstruments).