Summary
Dans ce rapport, nous démontrons techniques qui peuvent être utilisées pour étudier la biologie de l'intestin postérieur écrevisses. Nous montrons comment disséquer un abdomen écrevisses et étudier l'anatomie associés, la physiologie et la modulation de l'activité. L'activité péristaltique et la force des contractions sont mesurées en utilisant un capteur de force.
Abstract
Le but du rapport est de décrire les techniques de dissection pour la préparation de l'intestin postérieur écrevisses et pour montrer comment faire des enregistrements physiologiques avec un capteur de force pour contrôler la force de contraction. En outre, nous démontrons comment surveiller visuellement l'activité péristaltique, qui peut être utilisé comme un test biologique pour les différents peptides, amines biogènes et des neurotransmetteurs. Cette préparation se prête à des laboratoires étudiant la physiologie et de démontrer des concepts pharmacologiques pour les étudiants. Cette préparation a été en usage depuis plus de 100 ans, et il offre encore beaucoup comme un modèle pour étudier la génération et la régulation des rythmes péristaltique et pour décrire les mécanismes sous-jacents de leur modulation. Les essais pharmacologiques et des récepteurs de sous-typage qui ont commencé il ya 50 ans sur le hindgut contribuent toujours à la recherche d'aujourd'hui. Cette préparation robuste est bien adapté à la formation des étudiants en physiologie et pharmacologie.
Protocol
1. Présentation
L'aperçu plus récente de l'intestin postérieur écrevisses a été respectée dans une dissertation par le Dr Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Géorgie, USA), qui portait principalement sur la modulation sérotoninergique et l'innervation (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crustacés ont d'abord été étudiée il ya 100 ans par les Alexandrowicz, un pionnier dans l'anatomie comparée (Alexandrowicz, 1909), qui a décrit les divers aspects de leur innervation. La recherche s'est poursuivie au fil des années, d'identifier les types de couches de muscles et de l'architecture, s'adressant à la fonction globale de l'intestin postérieur dans l'osmorégulation chez l'animal entier, et en examinant le contrôle de modulation de la contractilité hindgut par divers composés (voir revue par Musolf, 2007). Il est intéressant de noter que la portion anale de l'intestin postérieur agit non seulement à expulser les selles, mais aussi de prendre l'eau de l'environnement pour l'osmorégulation. Cette région de l'intestin peut subir avant ou arrière selon le péristaltisme besoins de l'animal.
Alexandrowicz (1909) ont identifié deux plexus nerveux innervant l'intestin postérieur crustacé, une intérieure et une extérieure du plexus plexus, ce qui s'avéra plus tard être de riches sources pour identifier et caractériser les neurotransmetteurs. Dans le Florey 1950, le Dr Ernst a commencé une série d'études pharmacologiques sur l'intestin postérieur écrevisses et a démontré que les contractions sont modulées par l'acétylcholine et ses composés apparentés et aussi par l'adrénaline et la noradrénaline (Florey, 1954). Florey, le découvreur d'une substance inhibitrice connue comme «facteur-I", ont étudié les effets de cette substance sur diverses préparations, y compris le système gastro-intestinal chez les écrevisses (Florey, 1961). Facteur-I a été démontré plus tard à GABA. Ainsi, l'intestin postérieur écrevisses joué un rôle important dans les premières études de l'inhibition synaptique.
Après la découverte du GABA, d'autres émetteurs putatifs ont été également montré pour être associé à l'intestin postérieur plexus et de susciter des réactions physiologiques. Émetteurs comprennent la dopamine (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctoline (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) deux peptides orcokinin (NFDEIDRSGFGFN et AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al, 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) et un peptide myosuppressin (Mercier et al, 1997;... pQDLDHVFLRFamide plus probable, cf Stemmler et al 2007). Chacune de ces substances modulant les contractions spontanées hindgut, et tous sauf GABA semble être excitateurs. L'intestin postérieur répond également aux glutamate et quisqualate (Jones, 1962;. Mauvaise et al 2003), mais des preuves claires pour l'innervation glutamatergique n'a pas été signalée. Messagers intracellulaires qui influent sur les effets des émetteurs différents sont en grande partie inexplorée, mais il ya des preuves de l'implication de l'AMPc dans la capacité de la dopamine pour améliorer les contractions (Knotz & Mercier, 1995).
Bien que l'intestin postérieur crustacés contrats spontanément après dénervation, ces contractions sont généralement faibles et désorganisés (Pays de Galles, 1982; Winlow & Laverack, 1972a). Le mouvement péristaltique de sortie du moteur nécessite coordonné à partir du système nerveux central, apparemment originaires du dernier ganglion abdominal (Winlow & Laverack, 1972a, b, c). Dans les écrevisses, la puissance du moteur est effectué à l'intestin postérieur par la racine 7 ème abdominale, qui contient 75 axones dont les corps cellulaires sont localisés dans le ganglion dernière abdominale (Kondoh & Hisada, 1986). Au moins certains des peptides semblent être fournis au plexus hindgut à partir de neurones provenant du ganglion dernière abdominale (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al, 1991b; Siwicki & Bishop, 1986), mais la dopamine est fournie par les neurones dans plusieurs ganglions antérieure (Mercier et al. 1991a). Depuis la sortie du moteur grâce à la racine 7 ème abdominale est nécessaire pour les grands, les contractions coordonnées, il est probable que certains ou tous les émetteurs putatifs énumérés ci-dessus contribuent d'une certaine façon de péristaltisme. Leur contribution relative, cependant, ne sont pas connus. Certains aperçu peut être acquise par l'étude de leurs effets sur les muscles circulaires et longitudinaux séparément (Mercier & Lee, 2002).
En plus de contrôler le mouvement des aliments non digérés, le plexus nerveux associés à l'intestin postérieur crustacés semble jouer une fonction endocrine associée à la mue. L'intestin postérieur du crabe, Carcinus maenas, contient des cellules endocrines qui libèrent l'hormone hyperglycémiques crustacés et de son peptide précurseur liées au cours ecdysis (Webster et al. 2000), suggérant un rôle dans l'absorption d'eau et de gonflement associés à la mue. Ainsi, l'intestin postérieur crustacés participe à plusieurs processus physiologiques importants.
Ce rapport est principalement un outil d'enseignement pour l'école secondaire de pointe et les étudiants de premier cycle en cours de physiologie qui participent à l'expérimentation. L'importance ainsi que le mécanisme potentiel derrière comment les contrats hindgut et les fonctions peuvent être abordées par les élèves. Les agents pharmacologiques, les neurotransmetteurs et neurohormones seront utilisés, et les courbes dose-réponse sera construite, ce qui va amener les élèves à la façon d'acquérir et interpréter les données physiologiques et pharmacologiques. Une compréhension générale de la fonction du récepteur à l'égard des agonistes et antagonistes peuvent aussi être atteints. Les étudiants apprendront aussi à présenter des données sous forme graphique pour l'analyse statistique.
Il est très facile de disséquer et d'enregistrer les contractions de l'intestin postérieur écrevisses. Dans la préparation disséquée, l'intestin est facilement exposés à des substances exogènes. L'altération de l'activité péristaltique peut être contrôlé visuellement ou avec un capteur de force, qui peut aussi surveiller la force des contractions. En raison de sa simplicité et sa fiabilité en tant que préparation de bio-essais, l'intestin postérieur écrevisses est encore très utile pour étudier les questions de recherche beaucoup sur les mécanismes de péristaltisme, la modulation de puissance du moteur et la contraction musculaire, et la fonction du récepteur. L'intestin postérieur est également utile pour les insecticides tests, crustaceancides, et les polluants pour les mécanismes d'actions spécifiques.
2. Méthodes
2.1) Matières
- écrevisse
- écrevisses salines
- instruments de dissection (ciseaux grossière et fine, grossière et une pince fine)
- Sylgard à fond plat de Pétri
- tiges d'acier dissection
- béchers (pour retenir des solutions chimiques)
- parafilm (pour couvrir le mélange et solutions)
2.2) Dissection
- Ecrevisses (Procambarus clarkii) mesurant 6-10 cm de longueur du corps doit être placé sur la glace pendant 5 à 10 minutes à anesthésier l'animal avant dissection débute.
- Tenir les écrevisses anesthésiés par derrière les griffes d'une seule main. Rapidement, coupé de la cavité de l'œil au milieu de la tête sur les deux faces, puis décapiter les écrevisses (Remarque: le sang de la préparation sera collante quand elle sèche, donc lavez les outils une fois rempli).
Figure 1: Décapitation de l'écrevisse - Coupez le chélipèdes et les jambes de marche.
- Coupez les ailerons gauche et à droite, ne laissant que la nageoire caudale du milieu (uropode).
- Sur la face dorsale de l'écrevisse coupé ventralement la fois sur le côté gauche et à droite de la cuticule dorsale.
Figure 2: Retrait de cuticule dorsale - Couper transversalement sur la face dorsale de la cuticule, en s'assurant que la coupe est peu profonde pour éviter d'endommager l'IG Ensuite, retirer la partie inférieure de la cuticule dorsale abdominale.
- Placez les écrevisses disséqué dans un plat Sylgard fourrées.
- Epingler les écrevisses à l'antenne à la pointe de la nageoire caudale. On peut utiliser plusieurs broches de chaque côté de l'IG en tant que nécessaire pour maintenir le corps vers le bas.
- Remplir le plat avec une solution saline écrevisses couvrant l'IG Assurez-vous de toujours éteindre le GI avec une solution saline à l'aide d'une pipette. Saline est une solution modifiés Van Harreveld (1936), ce qui est fait avec 205 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl; 13,5 mM CaCl 2, 2H 2 O; 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM d'HEPES et ajusté à pH 7,4. L'écrevisse disséqués doit apparaître comme le montre la figure 3.
Figure 3: écrevisses disséqué avec IG intactes.
2.3) Expériences
2.3.1) Les contractions de l'animal
- Avez-solutions du composé à tester prêt et à la même température que la solution saline de bain. Sur pourraient utiliser des solutions individuelles de la sérotonine (100 nM, 1microM), le glutamate (1microM), et de la dopamine (1microM) faite dans une solution saline écrevisses comme substances de départ pour être testés.
- Autoriser l'écrevisse disséqués à s'asseoir dans la solution des écrevisses pendant environ dix minutes pour lui permettre de s'ajuster au choc de la dissection et l'exposition saline. Les contractions lentes péristaltisme de l'intestin postérieur devrait commencer à produire.
- Une fois les contractions commencent, d'enregistrer le nombre de contractions qui se produisent dans une trentaine de secondes (noter le type de contractions qui se produisent: Type péristaltisme-dire, ou spastique, et la direction de toute ondes péristaltiques).
Tableau 1: Les contractions dans les écrevisses SalineNombre de contractions Type de contractions - L'utilisation d'un PIPette, enlever la solution saline dans la cavité de l'abdomen de l'écrevisse exposés, et appliquer une solution saline contenant la substance à examiner directement sur le postérieur.
- Immédiatement après l'ajout de la solution, enregistrer le nombre de contractions qui surviennent après trente secondes et noter le type de contractions qui se produisent (c.-péristaltique, ou spastique).
Tableau 2: Contractions à l'exposition aux composésComposé testé Concentration Nombre de contractions Type de contractions - Immédiatement après l'enregistrement de la réponse à la substance d'essai, rincer la fois de plusieurs GI avec une solution saline normale écrevisses. Laissez la préparation reposer pendant 5 minutes, tout en rinçant toutes les 30 secondes avec une solution saline écrevisses.
- Avec une pipette, placer quelques saline contenant le composé suivant à examiner ou à une concentration de la substance variée derniers testés directement sur le postérieur. Il est préférable de commencer avec une concentration plus faible et la façon dont une œuvre à des concentrations plus élevées.
- Immédiatement après l'ajout de chaque nouvelle substance ou chaque nouvelle concentration, enregistrer le nombre de contractions qui surviennent après trente secondes et noter le type de contractions.
2.3.2) L'enregistrement des forces de contraction dans les préparations excisées
Figure 4: Installation
- Fixez le transducteur à la nacelle du pont.
- Fixez le pont à la gousse de 26T PowerLab.
- Fixez le 26T PowerLab au port USB de l'ordinateur.
- Ouvrez LabChart7, en cliquant sur l'icône labchart7 sur le bureau.
- La zone Centre LabChart Bienvenue apparaîtra ouvert. Fermez-le.
- Cliquez sur Setup
- Cliquez sur Paramètres canal. Changer le nombre de canaux à 1 (en bas à gauche de la boîte) Appuyer sur OK.
- En haut à gauche de la carte de l'ensemble de cycles par seconde à environ 2k. Réglez le volts (axe Y) à environ 500 ou 200 mV.
- Cliquez sur le canal 1 sur la droite du graphique. Cliquez sur l'amplificateur d'entrée. Assurez-vous que les paramètres: single-ended, couplage AC, et inverser (inverse le signal si nécessaire), et d'anti-alias, sont vérifiées.
- Pour commencer l'enregistrement appuyer sur start.
- Ramasser la préparation et couper le tube digestif à la jonction entre le thorax et l'abdomen. Puis couper soigneusement autour de la partie telson de la queue. Retirer le tube digestif de l'écrevisse disséqué et le placer dans le plat Sylgard. Il ya un vaisseau sanguin qui longe la face dorsale du tube digestif. Retirez soigneusement ce loin du tractus gastro-intestinal. Verser salines écrevisses fraîches sur la préparation.
- Placez le capteur de force dans la pince à proximité de l'écrevisse disséqués.
- Accrocher le capteur de force dans l'IG écrevisses comme dans la Figure 5.
Figure 5: hindgut isolés de l'écrevisse dans une solution saline attachée au crochet du capteur de force - Attendez jusqu'à ce que l'IG commence à se contracter, et appuyez sur Start sur la LabChart7.
- Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez "stop", et ajouter un commentaire étiquetés », Saline seulement». Remplissez le tableau 4.
Tableau 4: Les contractions avec un composé d'intérêtNombre de contractions L'amplitude des contractions (mV) - Ajouter les composés à tester d'intérêt, et immédiatement push "démarrer" sur le LabChart7.
- Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez «stop» et d'ajouter un commentaire directement sur le fichier graphique de ce que la substance a été ajoutée et sa concentration. Remplissez le tableau ci-dessous.
Tableau 5: Les contractions avec le composé _________Nombre de contractions L'amplitude des contractions (mV) - Rincer la préparation avec une solution saline d'écrevisses à l'aide d'une pipette.
- Ajouter d'autres substances ou diverses concentrations d'une manière semblable. Immédiatement push "démarrer" sur le LabChart7.
- Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez "stop", et ajoutez un commentaire et l'étiquette directement sur le fichier graphique indiquant le compound utilisé et la concentration.
3. Analyse des données
- De 2.3.1 de l'expérience, un graphique le nombre de contractions de chaque solution (une solution saline, la sérotonine, glutamate) en fonction du temps. Expliquez toutes les tendances.
- De 2.3.2 de l'expérience, un graphique le nombre de contractions de chaque solution (une solution saline, la sérotonine, glutamate) vs l'amplitude des contractions en mV. Expliquez toutes les tendances.
3.1) Mesure de la vitesse et la force des contractions
Pour indexer les tarifs des contractions sur le pouvez mesurer le temps depuis le début sur une flèche au début de la prochaine ou compter les débattements total sur une ou deux minutes. Les valeurs peuvent ensuite être mis en termes de contractions par minute ou seconde par fonction de la rapidité de leur apparition.
Pour indexer la force des contractions d'une mesure relative pourrait être utilisé pour comparer différentes conditions. Sur le fichier enregistré, on peut utiliser le marqueur «M» et de passer à la ligne de base. Utilisez ensuite le curseur et de passer à l'apogée de la déviation et prendre note de la valeur indiquée en haut à droite de l'écran comme une valeur delta (la différence de M à la pointe). Notez le curseur doit être maintenu immobile pendant la mesure du changement. Puis déplacez le M de la forme la prochaine vague d'intérêt et de répéter la mesure.
Discussion
Les détails fournis dans le film et le texte associé décrivent les étapes clés nécessaires pour enregistrer l'activité dans l'intestin postérieur de l'écrevisse in situ ainsi que in vitro. Un des objectifs de notre rapport est d'augmenter la sensibilisation au potentiel de cette préparation dans gérée par des étudiants des laboratoires d'investigation qui enseigner les concepts fondamentaux en physiologie et pharmacologie.
Ces préparations peuvent être utilisées pour enquêter sur un certain nombre de questions expérimentales qui mèneront à une meilleure compréhension des fonctions physiologiques de l'intestin postérieur. Les mécanismes sous-jacents réglementation des ondes péristaltiques et de son retournement ne sont pas encore connues. Les mécanismes de renforcement du contrôle sur l'ensemble du tractus gastro-intestinal sont également pas entièrement comprise. La question de savoir comment les centres supérieurs d'intégrer leurs activités avec la sortie nerveux autonome qui contrôle directement le système gastro-intestinal reste un espace ouvert d'enquête (Shuranova et al., 2006). En outre, les capacités de l'intestin postérieur osmorégulation crustacés et les fonctions d'osmorégulation au cours du stress mue et l'environnement n'ont pas été complètement élucidée. Il ya encore beaucoup de questions en attente de réponses dans cette préparation.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Soutenue par l'Université du Kentucky, Département de biologie, Bureau des études de premier cycle et le Collège des Arts et des Sciences.
Materials
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References
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