Summary
I denna rapport visar vi tekniker som kan användas för att undersöka biologi kräftor hindgut. Vi visar hur man kan dissekera en kräfta buken och studera tillhörande anatomi, fysiologi och modulering av aktivitet. Den peristaltiska aktiviteten och styrka sammandragningar mäts med en kraftgivare.
Abstract
Syftet med rapporten är att beskriva dissektion tekniker för att förbereda kräftor hindgut och visa hur man gör fysiologiska inspelningar med en kraftgivare att övervaka styrka kontraktion. Dessutom visar vi hur man visuellt övervaka peristaltiska verksamhet, som kan användas som biologiska testsystem för olika peptider, biogena aminer och signalsubstanser. Denna beredning är mottaglig för studerande laboratorier i fysiologi och för att visa farmakologiska begrepp för eleverna. Detta preparat har använts i över 100 år, och det fortfarande finns mycket som en modell för att undersöka generering och reglering av peristaltiska rytmer och för att beskriva de mekanismer som ligger bakom deras modulering. Den farmakologiska analyser och receptor sub-skriva som startade för över 50 år sedan på hindgut bidrar fortfarande till forskning idag. Denna robusta preparatet lämpar sig väl för utbildning studenter i fysiologi och farmakologi.
Protocol
1. Inledning
Den senaste omfattande översikt av kräftor hindgut har iakttagits i en avhandling av Dr Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), som främst inriktad på serotonerga modulering och innervationen (Musolf et al. 2009 ). Kräftdjur hindguts var först studerade över 100 år sedan av Alexandrowicz, en pionjär inom jämförande anatomi (Alexandrowicz, 1909), som beskrev olika aspekter av deras innervation. Forskningen fortsatte under åren, identifiera de typer av muskel lager och arkitektur, behandla det allmänna funktion hindgut i osmoregulation för hela djuret, och undersöka modulerande styrning av hindgut kontraktiliteten av olika föreningar (se recension av Musolf, 2007). Det är intressant att notera att det anala delen av hindgut fungerar inte bara att utvisa avföring, men också att ta upp vatten från omgivningen för osmoregulation. Denna region i tarmen kan genomgå framåt eller bakåt peristaltiken beroende på djurets behov.
Alexandrowicz (1909) identifierade två nerv plexuses innervating de kräftdjur hindgut, en inre plexus och en yttre plexus, som senare visade sig vara rika källor för att identifiera och karakterisera signalsubstanser. På 1950-talet dr Ernst Florey började en serie av farmakologiska studier på kräftor hindgut och visade att värkarna moduleras av acetylkolin och dess relaterade föreningar och även av adrenalin och noradrenalin (Florey, 1954). Florey, upptäckaren av en hämmande substans som kallas "Factor-I", studerat effekterna av detta ämne på olika förberedelser, bland annat GI-systemet i kräftor (Florey, 1961). Factor-Jag var senare visat sig vara GABA. Således spelade kräftor hindgut en viktig roll i den tidiga studier av synaptisk hämning.
Efter upptäckten av GABA, andra förmodad sändare också visat sig vara associerade med hindgut plexuses och att framkalla fysiologiska reaktioner. Sådana sändare inkluderar dopamin (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH,. Mercier et al 1997) två orcokinin peptider (NFDEIDRSGFGFN och AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) och en myosuppressin peptid (Mercier et al 1997,... troligen pQDLDHVFLRFamide, jfr Stemmler et al 2007). Vart och ett av dessa ämnen modulerar spontana hindgut sammandragningar, och alla utom GABA verkar vara excitatoriska. Den hindgut också ett svar på glutamat och quisqualate (Jones, 1962;. Fel et al 2003), men tydliga bevis för glutamaterg innervation har inte rapporterats. Intracellulära budbärare som förmedlar effekterna av de olika sändarna är i stort sett outforskade, men det finns bevis för inblandning av cAMP i dopamin förmåga att förbättra sammandragningar (Knotz & Mercier, 1995).
Även om kräftdjur hindgut kontrakt spontant efter denervering sådana sammandragningar är typiskt svag och oorganiserad (Wales, 1982; Winlow & Laverack, 1972a). Peristaltiska rörelsen kräver samordnade motoreffekt från det centrala nervsystemet, uppenbarligen har sitt ursprung i den sista buken ganglion (Winlow & Laverack, 1972a, b, c). I kräftor, är motorn effekt transporteras till hindgut genom 7: e abdominal rot, som innehåller 75 axoner vars celler kroppar är lokaliserade i den sista buken ganglion (Kondoh & Hisada, 1986). Åtminstone några av de peptider verkar vara levereras till hindgut plexus från nervceller har sitt ursprung i den sista buken ganglion (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al 1991b; Siwicki & Bishop, 1986), men dopamin levereras av nervceller i mer främre ganglierna (Mercier et al. 1991a). Sedan motoreffekt genom 7: e buken roten är nödvändig för stora, samordnade sammandragningar, är det troligt att några eller alla av de förmodade sändare som anges ovan bidra på något sätt att peristaltiken. Deras relativa bidrag, dock inte är kända. Vissa insikter kan vinnas genom att studera deras effekter på cirkulära och längsgående muskler separat (Mercier & Lee, 2002).
Förutom att kontrollera flödet av osmält mat, visas nerv plexus i samband med kräftdjur hindgut att spela en viktig endokrina funktioner i samband med ömsat. Den hindgut av krabba, Carcinus maenas innehåller endokrina celler som frigör kräftdjur hyperglykemiska hormon och dess relaterade föregångare peptid under ecdysis (Webster et al. 2000), vilket tyder på en roll i vattenupptagning och svullnad i samband med ömsat. Således deltar skaldjur hindgut i flera viktiga fysiologiska processer.
Denna rapport är främst ett pedagogiskt verktyg för avancerade gymnasiet och studenter i fysiologi kurser som deltar i experiment. Betydelse liksom de potentiella mekanismen bakom hur hindgut kontrakt och funktioner kan hanteras av eleverna. Farmakologiska agenter, signalsubstanser och neurohormoner kommer att användas, och dos-respons-kurvor ska byggas, vilket kommer att engagera eleverna i hur att förvärva och tolka fysiologiska och farmakologiska data. En allmän förståelse av receptor funktion med avseende på agonister och antagonister kan också uppnås. Studenterna får också lära dig att presentera data i grafisk form för statistisk analys.
Det är väldigt lätt att dissekera och spela sammandragningar från kräftor hindgut. I dissekerade förberedelse, är tarmen lätt utsätts för exogena ämnen. Den förändring i peristaltiska aktiviteten kan övervakas visuellt eller med en kraftgivare, som också kan övervaka kraft sammandragningar. På grund av dess enkelhet och pålitlighet som en bioassay förberedelse är kräftor hindgut fortfarande mycket användbar för att undersöka många forsknings frågor om mekanismerna för peristaltiken, modulering av motoriska produktion och muskelkontraktion, och receptor funktion. Den hindgut är också användbart för testning insektsmedel, crustaceancides och föroreningar för särskilda mekanismer åtgärder.
2. Metoder
2,1) Material
- kräftor
- kräftor saltlösning
- dissektion instrument (grov & fin sax, grov & fin pincett)
- Sylgard botten petriskål
- stål dissekera stift
- bägare (för att hålla kemiska lösningar)
- parafilm (för att täcka och omrörare)
2,2) Dissection
- Kräftor (Procambarus clarkii) mäter 60-10 cm i kroppslängd bör placeras på is i 5 till 10 minuter att söva djuret före dissekering börjar.
- Håll sövs kräftor från bakom klorna med en hand. Snabbt, klippt från ögonhålan till mitten av huvudet på båda sidor, och sedan halshugga kräftor (Obs: blodet från beredningen kommer att klibbig när den torkar, så tvätta verktyg när den är klar).
Figur 1: Halshuggning av kräftor - Skär av chelipeds och promenader ben.
- Skär av vänster och höger tailfins bara lämna mitt tailfin (uropod).
- På ryggsidan av kräftor skära ventralt på både vänster och höger sida av rygg nagelbanden.
Figur 2: Borttagning av ryggfenan Cuticle - Skäras på tvären på ryggsidan av nagelband, se till att snittet är grund för att förhindra skador på GI sedan bort nedre delen av ryggen buken nagelbanden.
- Placera dissekerade kräftor i en Sylgard-fodrad skålen.
- Nåla fast kräftorna i skålen vid spetsen av stjärtfenan. Man kan använda fler stift på båda sidor om GI som behövs för att hålla kroppen nere.
- Fyll skålen med kräftor saltlösning som täcker GI Se till att kontinuerligt släck GI med koksaltlösning med en pipett. Saline är en modifierad Van Harreveld lösning (1936), som är gjord med 205 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 13,5 mm CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES och justeras till pH 7,4. Den dissekerade kräftor ska visas som i figur 3.
Figur 3: dissekerade kräftor med GI intakt.
2,3) Experiment
2.3.1) Sammandragningar i djurets
- Har lösningar av substansen som ska testas redo och vid samma temperatur som bad koksaltlösning. På kan använda individuella lösningar av serotonin (100 nM, 1microM), glutamat (1microM) och dopamin (1microM) gjorde i kräftor saltlösning som att starta ämnen som ska testas.
- Låt dissekerade kräftor att sitta i kräftor lösningen för ca tio minuter för att kunna anpassa sig till den chock för dissekering och saltlösning exponering. Den långsamma peristaltiken sammandragningar från hindgut ska börja inträffa.
- När värkarna börjar registrera antalet sammandragningar som förekommer i trettio sekunder (notera vilken typ av sammandragningar som förekommer, dvs peristaltiken typ eller spastisk, och riktningen av peristaltiska vågor).
Tabell 1: sammandragningar i Kräftor SalineAntal Sammandragningar Typ av Sammandragningar - Med hjälp av en PIPette, ta bort saltlösning i hålrummet av kräftor blottade mage och tillämpa saltlösning som innehåller ämnet som skall undersökas direkt på hindgut.
- Omedelbart efter tillsättning av lösningen, registrera antalet kontraktioner som inträffar efter trettio sekunder och notera vilken typ av sammandragningar som sker (dvs peristaltisk eller spastisk).
Tabell 2: Sammandragningar med exponering för ämnenSammansatta testade Koncentration Antal Sammandragningar Typ av Sammandragningar - Omedelbart efter inspelningen svaret på testämnet, skölj GI flera gånger med vanliga kräftor saltlösning. Låt förberedelser stå i 5 minuter, under sköljningen ungefär var 30 sekunder med kräftor koksaltlösning.
- Med hjälp av en pipett, placera några saltlösning som innehåller nästa förening som skall höras eller en varierande koncentration av de sista ämnet testas direkt på hindgut. Det är bäst att börja med en lägre koncentration och arbeta sig fram till högre koncentrationer.
- Omedelbart efter tillägg av nya ämnen eller varje ny koncentration, registrera antalet kontraktioner som inträffar efter trettio sekunder och notera vilken typ av sammandragningar.
2.3.2) Inspelning krafter nedgång i exciderades förberedelser
Figur 4: Inställning
- Fäst givaren till bron pod.
- Fäst bron pod till PowerLab 26T.
- Fäst PowerLab 26T till USB-porten på datorn.
- Öppna LabChart7, genom att klicka på labchart7 ikonen på skrivbordet.
- Den LabChart Welcome Center ruta poppar öppna. Stänga det.
- Klicka på Inställningar
- Klicka på kanal inställningar. Ändra antal kanaler till 1 (nedre vänstra hörnet av rutan) tryck på OK.
- Längst upp till vänster i diagrammet anger cykler per sekund till cirka 2k. Ställ volt (y-axel) till cirka 500 eller 200 mV.
- Klicka på Kanal 1 till höger i diagrammet. Klicka på Input förstärkare. Se till att inställningarna: single-ended, AC kopplade, och invertera (inverterar signalen om det behövs), och anti-alias, kontrolleras.
- Till att börja starta inspelningen trycker på.
- Plocka upp förberedelserna och skär mag-tarmkanalen vid föreningspunkt mellan bröstkorgen och buken. Sedan försiktigt skära runt den mellersta stjärtfenan delen av svansen. Ta bort mag-tarmkanalen från dissekerade kräftor och placera den i Sylgard skålen. Det är ett blodkärl som löper längs ryggens aspekten av mag-tarmkanalen. Dra försiktigt bort den från mag-tarmkanalen. Häll färska kräftor saltlösning på förberedelser.
- Placera kraftgivare i klämman nära dissekeras kräftor.
- Haka kraftgivare i kräftor GI som visas i Figur 5.
Figur 5: Isolerade hindgut av kräftor i saltlösning fäst kroken i kraftgivare - Vänta tills GI börjar kontrakt, och mejselstart på LabChart7.
- Låt programmet köra i ca 20 sekunder. Tryck på "stopp" och lägga till en kommentar etiketten "Saline bara". Fyll i tabell 4.
Tabell 4: Sammandragningar med sammansatt av intresseAntal Sammandragningar Amplitud Sammandragningar (mV) - Lägg till testet föreningar av intresse, och omedelbart tryck "start" på LabChart7.
- Låt programmet köra i ca 20 sekunder. Tryck på "stop" och lägga till en kommentar direkt i kartbilden filen om vad ämnet inkom och dess koncentration. Fyll i tabellen nedan.
Tabell 5: Sammandragningar med _________ föreningAntal Sammandragningar Amplitud Sammandragningar (mV) - Skölj av preparatet med kräftor koksaltlösning med en pipett.
- Lägg till andra ämnen eller olika koncentrationer på liknande sätt. Omedelbart tryck "start" på LabChart7.
- Låt programmet köra i ca 20 sekunder. Tryck på "stopp" och lägg en kommentar och etikett direkt i kartbilden filen anger compound används och koncentrationen.
3. Data Analysis
- Från 2.3.1 av experimentet, diagram antalet sammandragningar från varje lösning (saltlösning, serotonin, glutamat) vs tid. Förklara eventuella trender.
- Från 2.3.2 av experimentet, diagram antalet sammandragningar från varje lösning (saltlösning, serotonin, glutamat) jämfört med amplituden på sammandragningar i mV. Förklara eventuella trender.
3,1) Mätning av hastighet och kraft sammandragningar
Att indexera andelen sammandragningar på kan mäta tiden från början på en omläggning till början av nästa eller räkna den totala deformationen över en minut eller två. Värdena kan sedan sättas i termer av sammandragningar per minut eller per sekund beroende på hur snabba de förekommer.
Att indexera kraft sammandragningar ett relativt mått kan användas för att jämföra olika förutsättningar. På den sparade filen kan man använda markören "M" och flytta till baslinjen. Använd sedan markören och flytta till toppen av deformationen och ta del av det värde som anges på upp till höger på skärmen som ett delta värde (skillnaden från M till toppen). Notera markören måste hållas stilla för åtgärden av förändringen. Flytta sedan M för att nästa våg form av räntor och upprepa åtgärden.
Discussion
Vad som föreskrivs i den tillhörande filmen och text beskriver de viktigaste stegen som behövs för att registrera aktiviteten i hindgut av kräftor på plats liksom in vitro. Ett mål för vår rapport är att öka medvetenheten om potentialen för denna beredning i student-run undersökande laboratorier som undervisar grundläggande begrepp i fysiologi och farmakologi.
Dessa preparat kan användas för att undersöka ett antal experimentella frågor som kommer att leda till en bättre förståelse av fysiologiska funktioner hindgut. Mekanismerna bakom regleringen av peristaltiska vågor och deras återföring är ännu inte kända. Mekanismerna för större kontroll av hela mag-tarmkanalen är också inte helt klarlagda. Frågan om hur högre centra integrera sin verksamhet med det autonoma utgång som direkt styr GI-systemet är ett öppet område undersökning (Shuranova et al., 2006). Dessutom har de osmoregulatory kapacitet kräftdjur hindgut och funktioner osmoregulation under ömsat och miljömässig stress inte helt klarlagd. Det finns fortfarande många frågor väntar på svar i denna beredning.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Med stöd av University of Kentucky, Institutionen för biologi, Office studierektor och College of Arts & Sciences.
Materials
|
References
- Alexandrowicz, J. S. Zur Kenntnis des sympathischen Nervensystems der Crustaceae. Jena Z. Naturw. 45, 395-444 (1909).
- Bungart, D., Dircksen, H., Keller, R. Quantitative determination and distribution of the myotropic neuropeptide orcokinin in the nervous system of astacidean crustaceans. Peptides. 15, 393-400 (1994).
- Dircksen, H., Burdzik, S., Sauter, A., Keller, R. Two orcokinins and the novel octapeptide orcomyotropin in the hindgut of the crayfish Orconectes limosus: identified myostimulatory neuropeptides originating totether in neurons of the terminal abdominal ganglion. J. Exp. Biol. 203, 2807-2818 (2000).
- Elekes, K., Florey, E., Cahil, M. A., Hoeger, U., Geffard, M. Morphology, synaptic connections and neurotransmitters of the efferent neurons of the crayfish hindgut. Neurobiology of Invertebrates. Salanki, J., Rosza, K. 36, Akademiai Kiado. Budapest. 129-146 (1988).
- Elofsson, R., Kauri, T., Nielsen, S. O., Stroemberg, J. O. Catecholamine-containing nerve fibres in the hindgut of the crayfish Astacus astacus L. Experentia. 24, 1159-1160 (1968).
- Florey, E. Uber die wirkung von acetylcholin, adrenalin, nor-adrenalin, faktor I und anderen substanzen auf den isolierten enddarm des flusskrebses Cambarus clarkii Girard. Z. Vergl. Physiol. 36, 1-8 (1954).
- Florey, E. A new test preparation for bio-assay of Factor I and gamma-aminobutyric acid. J. Physiol. 156, 1-7 (1961).
- Jones, H. C. The action of L-glutamic acid and of structurally related compounds on the hind gut of the crayfish. J. Physiol. (London). 164, 295-300 (1962).
- Knotz, S., Mercier, A. J. cAMP mediates dopamine-evoked hindgut contractions in the crayfish, Procambarus clarkii. Comp. Biochem. Physiol. 111A, 59-64 (1995).
- Kondoh, Y., Hisada, M. Neuroanatomy of the terminal (sixth abdominal) ganglion of the crayfish, Procambarus clarkii. Cell. Tiss. Res. 243, 273-288 (1986).
- Mercier, A. J., Lange, A. B., TeBrugge, V., Orchard, I. Evidence for proctolin-like and FMRFamide-like neuropeptides associated with the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 75, 1208-1225 (1997).
- Mercier, A. J., Lee, J. Differential effects of neuropeptides on circular and longitudinal muscles of the crayfish hindgut. Peptides. 23, 1751-1757 (2002).
- Mercier, A. J., Orchard, I., Schmoeckel, A. Catecholaminergic neurons supplying the hindgut of the crayfish, Procambarus clarkii. Can. J. Zool. 69, 2778-2785 (1991).
- Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V. FMRFamide-like immunoreactivity in the crayfish nervous system. J. exp. Biol. 156, 519-538 (1991).
- Mercier, A. J., Orchard, I., TeBrugge, V., Skerrett, M. Isolation of two FMRFamide-related peptides from crayfish pericardial organs. Peptides. 14, 137-143 (1993).
- Musolf, B. E. Serotonergic modulation of the crayfish hindgut: Effects on hindgut contractility and regulation of serotonin on hindgut. Biol Bull. , Georgia State University. (2007).
- Musolf, B. E., Spitzer, N., Antonsen, B. L., Edwards, D. H. Serotonergic modulation of crayfish hindgut. Biol Bull. 217(1), 50-64 (2009). Biol Bull. 217, 50-64 (2009).
- Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Cooper, R. L. A hundred years ago and now: A short essay on the study of the crustacean hindgut. (Vor hundert Jahren und nun: Eine kurze Geschichte von die Forschung des Hinterdarmes der Crustaceen. Crustaceana. 76, 755-670 (2003).
- Shuranova, Z. P., Burmistrov, Y. M., Strawn, J. R., Cooper, R. L. Evidence for an Autonomic Nervous System in Decapod Crustaceans. International Journal of Zoological Research. 2 (3), 242-283 (2006).
- Siwicki, K. K., Bishop, C. A. Mapping of proctolinlike immunoreactivity in the nervsou systems of lobster and. 243, 435-435 (1986).
- Stemmler, E. A., Cashman, C. R., Messinger, D. I., Gardner, N. P., Dickinson, P. S., Christie, A. D. High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders. Peptides. 28, 2104-2115 (2007).
- Sandeman, D. C., Atwood, H. L. Control of mouthparts and gut. The Biology of Crustacea. 4, Academic Press Inc. London. 165-191 (1982).
- Webster, S. G., Dircksen, H., Chung, J. S. Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide. J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity. Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output. Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).
- Winlow, W., Laverack, M. S. The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies. Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).
- Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut. J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).
