Summary
En este informe se muestran las técnicas que se pueden utilizar para investigar la biología del cangrejo de río del intestino grueso. Se muestra cómo la disección de un cangrejo de río abdomen y el estudio de la anatomía asociada, la fisiología y la modulación de la actividad. La actividad peristáltica y la fuerza de las contracciones se miden con un transductor de fuerza.
Abstract
El propósito del informe es describir las técnicas de disección para la preparación del intestino grueso cangrejo de río y de demostrar cómo hacer grabaciones fisiológicas con un transductor de fuerza para controlar la fuerza de contracción. Además, se demuestra cómo controlar visualmente la actividad peristáltica, que puede ser utilizado como un bioensayo de diversos péptidos, aminas biogénicas y neurotransmisores. Esta preparación es susceptible a los laboratorios de los estudiantes en la fisiología y para demostrar conceptos farmacológicos a los estudiantes. Esta preparación ha estado en uso durante más de 100 años, y todavía ofrece mucho como modelo para la investigación de la generación y regulación de los ritmos y peristáltico para describir los mecanismos que subyacen a su modulación. Los ensayos farmacológicos y de los receptores de subtipos que se iniciaron hace 50 años en el intestino grueso siguen contribuyendo a la investigación hoy en día. Esta preparación sólida se adapta bien a la formación de estudiantes en la fisiología y la farmacología.
Protocol
1. Introducción
La visión de conjunto más reciente del intestino grueso cangrejo de río se ha cumplido en una disertación de la Dra. Barbara E. Musolf (2007, Universidad Estatal de Georgia, Atlanta, Georgia, EE.UU.), que se centró principalmente en la modulación serotoninérgica y la inervación (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crustáceos se estudió por primera vez hace 100 años por Alexandrowicz, un pionero en anatomía comparada (Alexandrowicz, 1909), que describe los diversos aspectos de su inervación. La investigación continuó con los años, la identificación de los tipos de capas de músculo y de la arquitectura, dirigiéndose a la función general del intestino grueso en la osmorregulación de todo el animal, y el examen de control modulador de la contractilidad del intestino grueso por varios compuestos (ver la revisión de Musolf, 2007). Es interesante notar que la parte anal del intestino grueso sirve no sólo para expulsar las heces, sino también para tomar el agua del ambiente para la osmorregulación. Esta región del intestino puede sufrir directa o inversa peristalsis en función de las necesidades del animal.
Alexandrowicz (1909) identificó dos plexos nerviosos que inervan el intestino grueso crustáceos, una interior y otra exterior del plexo plexo, que más tarde resultó ser una rica fuente para la identificación y caracterización de los neurotransmisores. En la década de 1950 Florey Dr. Ernst comenzó una serie de estudios farmacológicos en el intestino grueso cangrejo de río y ha demostrado que las contracciones son moduladas por la acetilcolina y sus compuestos relacionados, y también por la epinefrina y la norepinefrina (Florey, 1954). Florey, el descubridor de una sustancia inhibidora conocida como "Factor-I", estudió los efectos de esta sustancia en diversas preparaciones, incluyendo el sistema gastrointestinal en cangrejos de río (Florey, 1961). Factor que más tarde se demostró que GABA. Por lo tanto, el intestino grueso cangrejo juega un papel importante en los primeros estudios de inhibición sináptica.
Tras el descubrimiento de GABA, otros transmisores supuesto también demostraron estar asociados con los plexos del intestino grueso y producen respuestas fisiológicas. Transmisores incluyen la dopamina (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968)., Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) dos péptidos orcokinin (NFDEIDRSGFGFN y AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000). y un péptido myosuppressin (Mercier et al 1997;... pQDLDHVFLRFamide más probable, cf Stemmler et al 2007). Cada una de estas sustancias modula las contracciones espontáneas del intestino grueso, y todos, excepto GABA parece ser excitatorios. El intestino grueso también responde a glutamato y quiscualato (Jones, 1962;. Incorrecto et al 2003), pero la evidencia clara de la inervación glutamatérgica no ha sido reportado. Mensajeros intracelulares que median los efectos de los transmisores de diferentes son en gran parte inexplorado, pero no hay pruebas de la participación de cAMP en la capacidad de la dopamina para aumentar las contracciones (Knotz & Mercier, 1995).
Aunque el intestino grueso crustáceos contratos espontáneamente tras la denervación, las contracciones son generalmente débiles y desorganizados (Gales, 1982; Winlow y Laverack, 1972a). Requiere el movimiento peristáltico de salida coordinada del motor del sistema nervioso central, al parecer de origen en el ganglio abdominal anterior (Winlow y Laverack, 1972a, b, c). En cangrejos de río, la salida del motor se realiza a la del intestino grueso a través de la raíz 7 ª abdominal, que contiene 75 axones cuyos cuerpos celulares se localizan en el ganglio abdominal anterior (Kondoh y Hisada, 1986). Por lo menos algunos de los péptidos parecen ser suministrados en el plexo del intestino grueso de las neuronas de origen en el ganglio última abdominal (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al, 1991b; Siwicki y Bishop, 1986), pero la dopamina es suministrada por las neuronas de más ganglios anterior (Mercier et al. 1991a). Desde la salida del motor a través de la raíz 7 ª abdominal es necesaria para la contracción general, coordinada, es probable que algunos o todos de los transmisores de supuestos antes mencionados contribuyen de algún modo a la peristalsis. Sus contribuciones relativas, sin embargo, no se conocen. Alguna información puede ser obtenida mediante el estudio de sus efectos sobre los músculos circulares y longitudinales por separado (Mercier & Lee, 2002).
Además de controlar el movimiento de los alimentos no digeridos, el plexo nervioso asociado con el intestino grueso crustáceos parece desempeñar una función endocrina importante asociado con la muda. El intestino grueso de los cangrejos, Carcinus maenas, contiene células endocrinas que la liberación de hormonas crustáceos hiperglucemia y su péptido precursor relacionadas durante la ecdisis (Webster et al. 2000), sugiriendo un papel en la absorción de agua y la inflamación asociados con la muda. Por lo tanto, el intestino grueso crustáceo participa en diversos procesos fisiológicos importantes.
Este informe es sobre todo una herramienta de enseñanza para la escuela avanzada de secundaria y universitarios en los cursos de fisiología que participan en la experimentación. La importancia, así como el posible mecanismo detrás de la forma de los contratos y las funciones del intestino grueso pueden ser abordadas por los estudiantes. Agentes farmacológicos, los neurotransmisores, neurohormonas y se utilizará, y curvas dosis-respuesta se construirá, que los estudiantes participen en la forma de adquirir e interpretar los datos fisiológicos y farmacológicos. Un conocimiento general de la función del receptor con respecto a los agonistas y antagonistas también se puede lograr. Los estudiantes también aprenderán a presentar los datos en forma gráfica para el análisis estadístico.
Es muy fácil de analizar y registrar las contracciones del intestino grueso cangrejo de río. En la preparación disecada, el intestino es fácilmente expuestos a sustancias exógenas. La alteración en la actividad peristáltica se puede controlar visualmente o con un transductor de fuerza, que también puede controlar la fuerza de las contracciones. Debido a su simplicidad y fiabilidad como una preparación bioensayo, el intestino grueso cangrejo de río sigue siendo muy útil para la investigación de muchas preguntas de investigación sobre los mecanismos de la peristalsis, la modulación de la potencia del motor y la contracción muscular y la función del receptor. El intestino grueso es también útil para las pruebas insecticidas, crustaceancides, y los contaminantes de mecanismos específicos de las acciones.
2. Métodos
2.1) Materiales
- cangrejo de río
- cangrejos salinos
- instrumentos de disección (tijeras grueso y fino, grueso y unas pinzas finas)
- Sylgard de fondo placa de Petri
- disección de acero pines
- vasos (para mantener las soluciones químicas)
- parafina (para la cobertura de soluciones y mezcla)
2.2) La disección
- Cangrejo de río (Procambarus clarkii) que mide 10.6 cm de longitud del cuerpo debe ser colocado en hielo durante 5 a 10 minutos para anestesiar a los animales antes de la disección comienza.
- Mantener los cangrejos anestesiados por detrás de las garras con una sola mano. Rápidamente, procedente de la cuenca del ojo hasta la mitad de la cabeza a ambos lados, y luego decapitar a los cangrejos de río (Nota: la sangre de la preparación será pegajoso cuando se seca, así que lave las herramientas cuando esté terminado).
Figura 1: La decapitación de los cangrejos - Cortar el quelípedos y las piernas para caminar.
- Cortar el tailfins izquierda y derecha, dejando sólo la aleta caudal medio (uropod).
- En la parte dorsal del cangrejo corte ventral tanto en el lado izquierdo y derecho de la cutícula dorsal.
Figura 2: Eliminación de cutícula dorsal - Cortados transversalmente en la parte dorsal de la cutícula, asegurándose de que el corte es poco profundo para evitar daños a la GI A continuación, retire la parte inferior de la cutícula abdominal dorsal.
- Colocar los cangrejos disecados en un plato Sylgard a ambos lados.
- Pin de la langosta en el plato en la punta de la aleta caudal. Se puede utilizar más patas a cada lado de la GI es necesario para sostener el cuerpo hacia abajo.
- Llenar el recipiente con solución salina cangrejos de río que cubre el GI Asegúrese de apagar continuamente el GI con una solución salina con una pipeta. Solución salina es la solución de una modificación de Van Harreveld (1936), que se hace con 205 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 13,5 mM CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM de MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES y ajustado a pH 7,4. Los cangrejos de río disecado debe aparecer como se muestra en la Figura 3.
Figura 3: cangrejos disecados intactos con GI.
2.3) Los experimentos
2.3.1) Las contracciones en el animal
- Con soluciones del compuesto a analizar listo y en la misma temperatura que la solución salina de baño. Podría utilizar en las soluciones individuales de la serotonina (100 nM, 1microM), el glutamato (1microM) y dopamina (1microM) hizo en solución salina cangrejos de río como sustancias de partida para ser probado.
- Permita que los cangrejos disecados para sentarse en la solución de cangrejos de río durante unos diez minutos para permitir que se ajuste a la conmoción de la disección y exposición de solución salina. Las contracciones de peristaltismo lento el intestino grueso que comienzan a ocurrir.
- Una vez que comiencen las contracciones, anote el número de contracciones que se producen en treinta segundos (tenga en cuenta el tipo de contracciones que se producen: el tipo es decir, el peristaltismo, o espástica, y la dirección de cualquier ondas peristálticas).
Tabla 1: Las contracciones en el cangrejo de río SalineNúmero de contracciones Tipo de contracciones - El uso de un piPette, eliminar la solución salina dentro de la cavidad del abdomen descubierto el cangrejo de río, y aplicar solución salina que contiene la sustancia a examinar directamente en el intestino grueso.
- Inmediatamente después de la adición de la solución, registrar el número de contracciones que se producen después de treinta segundos y anotar el tipo de contracciones que se producen (es decir, peristálticas, o espástica).
Tabla 2: Las contracciones con la exposición a compuestosCompuesto ensayado Concentración Número de contracciones Tipo de contracciones - Inmediatamente después de grabar la respuesta a la sustancia, enjuagar varias veces con solución salina GI cangrejo normal. Deje que la preparación reposar por 5 minutos, mientras se lava cada 30 segundos con una solución salina cangrejos de río.
- Con una pipeta, colocar algunos salina que contiene el compuesto junto a examinar o una concentración de la sustancia variada última prueba directamente en el intestino grueso. Lo mejor es comenzar con una menor concentración y una forma de trabajo a altas concentraciones.
- Inmediatamente después de añadir cada nueva sustancia o cada nueva concentración, registrar el número de contracciones que se producen después de treinta segundos y anotar el tipo de contracciones.
2.3.2) El registro de las fuerzas de contracción en los preparativos eliminado
Figura 4: Configuración
- Conecte el transductor a la estación del puente.
- Coloque la cápsula del puente a la 26T PowerLab.
- Conecte el PowerLab 26T al puerto USB del ordenador.
- Abrir LabChart7, haciendo clic en el icono de labchart7 en el escritorio.
- La caja de LabChart Centro de Bienvenida se abrirá. Cerca de ella.
- Haga clic en Configuración
- Haga clic en configuración de canal. Cambiar el número de canales a 1 (parte inferior izquierda del cuadro) pulse OK.
- En la parte superior izquierda de la tabla del conjunto de ciclos por segundo a cerca de 2k. Establecer los voltios (eje Y) a unos 500 o 200 mV.
- Haga clic en el canal 1 a la derecha del gráfico. Haga clic en la entrada de amplificador. Asegúrese de que la configuración: un solo terminal, junto ac, y se invierte (se invierte la señal si es necesario), y anti-alias, se comprueban.
- Para comenzar a iniciar la grabación de prensa.
- Recoger la preparación y corte del tubo digestivo en la unión entre el tórax y el abdomen. A continuación, corte con cuidado alrededor de la parte telson de la cola. Retire el tubo digestivo de los cangrejos disecados y colocarlo en el plato Sylgard. No es un vaso sanguíneo que corre a lo largo de la cara dorsal del tracto gastrointestinal. Tire con cuidado esta distancia desde el tracto gastrointestinal. Vierta la solución salina cangrejos frescos en la preparación.
- Coloque el transductor de fuerza en la pinza de cangrejo de río cerca de la disección.
- Enganche el transductor de fuerza en el intestino del cangrejo de río, como se muestra en la Figura 5.
Figura 5: intestino grueso aislados de los cangrejos de río en una solución salina en el gancho del transductor de fuerza - Espere hasta que el GI comienza a contraerse, y empuje en el inicio LabChart7.
- Dejar que el programa funcionando durante unos 20 segundos. Haga click en "parar", y añadir un comentario etiquetados, "Saline sólo". Rellene el cuadro 4.
Tabla 4: Contracciones con el compuesto de interésNúmero de contracciones Amplitud de las contracciones (mV) - Añadir los compuestos de prueba de interés, e inmediatamente presionar "start" en el LabChart7.
- Dejar que el programa funcionando durante unos 20 segundos. Haga click en "stop" y añadir un comentario directamente en el archivo gráfico como a la sustancia que se añade y su concentración. Rellene el siguiente cuadro.
Tabla 5: Las contracciones con un compuesto de _________Número de contracciones Amplitud de las contracciones (mV) - Enjuague la preparación con solución salina cangrejos de río con una pipeta.
- Agregar otras sustancias o varias concentraciones de una manera similar. Inmediatamente empuje "start" en el LabChart7.
- Dejar que el programa funcionando durante unos 20 segundos. Haga click en "parar", y añadir un comentario y la etiqueta directamente en el archivo gráfico que indica el compound utilizado y la concentración.
3. Análisis de Datos
- Desde 2.3.1 del experimento, el gráfico el número de contracciones de cada solución (solución salina serotonina, glutamato) frente al tiempo. Explicar las tendencias.
- Desde 2.3.2 del experimento, el gráfico el número de contracciones de cada solución (solución salina, la serotonina, glutamato) frente a la amplitud de las contracciones en mV. Explicar las tendencias.
3.1) La medición de la velocidad y la fuerza de las contracciones
Para indexar las tarifas de las contracciones puede medir en el tiempo desde el principio en un desvío a la comienzo de la siguiente o el recuento de las deflexiones total de más de un minuto o dos. Los valores se pueden poner en términos de las contracciones por minuto o por segundo dependiendo de lo rápido que se están produciendo.
El índice de la fuerza de las contracciones de una medida relativa podría ser utilizado para comparar las diferentes condiciones. En el archivo guardado se puede utilizar la marca "M" y pasar a la línea de base. A continuación, utilice el cursor y pasar a la punta de la flecha y tomar nota del valor que aparece en la parte superior derecha de la pantalla como un valor delta (la diferencia de la M a la cima). Tenga en cuenta que el cursor se debe mantener inmóvil a la medida del cambio. A continuación, mueva la M de la forma siguiente ola de interés y repetir la medida.
Discussion
Los datos facilitados en la película y el texto asociado describen los principales pasos necesarios para registrar la actividad en el intestino grueso de los cangrejos de río in situ, así como in vitro. Uno de los objetivos de nuestro informe es aumentar la conciencia sobre el potencial de esta preparación de los estudiantes a ejecutar los laboratorios de investigación que enseñan conceptos fundamentales de la fisiología y la farmacología.
Estas preparaciones se pueden utilizar para investigar una serie de preguntas experimentales que conduzcan a una mejor comprensión de las funciones fisiológicas del intestino grueso. Los mecanismos subyacentes a la regulación de las ondas peristálticas y su reversión todavía no se conocen. Los mecanismos para un mayor control de todo el tracto gastrointestinal no se comprende totalmente. La cuestión de cómo integrar a los centros superiores de su actividad con la salida autonómica que controla directamente el sistema gastrointestinal sigue siendo un campo abierto de investigación (Shuranova et al., 2006). Además, las capacidades osmoregulatoria del intestino grueso crustáceos y las funciones de osmorregulación durante el estrés y la muda del medio ambiente no han sido completamente aclarada. Todavía hay muchas preguntas en espera de respuestas en esta preparación.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Con el apoyo de la Universidad de Kentucky, Departamento de Biología de la Oficina de Estudios de Grado y la Facultad de Artes y Ciencias.
Materials
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References
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