Summary
In diesem Bericht zeigen wir Techniken, die verwendet werden, um die Biologie des Krebses Enddarm untersuchen lassen. Wir zeigen, wie ein Krebs Bauch sezieren und untersuchen die damit verbundenen Anatomie, Physiologie und Modulation der Aktivität. Die peristaltische Aktivität und Stärke der Kontraktionen werden mit einem Kraftaufnehmer.
Abstract
Der Zweck des Berichts ist es, Dissektion Techniken zur Herstellung der Krebse Enddarm zu beschreiben und zu demonstrieren, wie die physiologischen Aufnahmen mit einem Kraftaufnehmer machen, um die Stärke der Kontraktion zu überwachen. Darüber hinaus zeigen wir, wie man visuell überwachen peristaltische Aktivität, die als Bioassay für verschiedene Peptide, biogene Amine und Neurotransmitter verwendet werden können. Dieses Präparat ist zugänglich für Schülerlabore in Physiologie und für den Nachweis der pharmakologischen Konzepte für Studenten. Dieses Präparat wird seit über 100 Jahren, und es bietet immer noch soviel wie ein Modell für die Untersuchung der Entstehung und Regulation der Peristaltik Rhythmen und für die Beschreibung der zugrunde liegenden Mechanismen ihrer Modulation. Die pharmakologischen Untersuchungen und Rezeptor-Sub-Typisierung, die vor über 50 Jahren auf dem Enddarm gestartet wurden noch dazu beitragen, Forschung heute. Diese robuste Vorbereitung ist gut an Ausbildung von Studenten in Physiologie und Pharmakologie geeignet.
Protocol
1. Einführung
Die jüngsten umfassenden Überblick über die Krebse Enddarm wurde in einer Dissertation von Dr. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), die in erster Linie auf serotonerge Modulation und Innervation (Musolf et al., 2009 konzentriert eingehalten ). Krustentier hindguts wurden erstmals vor über 100 Jahren von Alexandrowicz, ein Pionier in der vergleichenden Anatomie (Alexandrowicz, 1909), der die verschiedenen Aspekte ihrer Innervation beschrieben untersucht. Forschung weiterhin im Laufe der Jahre, die Identifizierung der Art der Muskelschichten und Architektur, Bewältigung der Gesamtfunktion der Enddarm in Osmoregulation für das ganze Tier, und die Prüfung modulatorische Kontrolle über Enddarm Kontraktilität durch verschiedene Verbindungen (siehe Review von Musolf, 2007). Es ist interessant festzustellen, dass die anale Teil der Enddarm wirkt nicht nur auf Kot zu vertreiben, sondern auch für die Aufnahme der Wasser aus der Umgebung für die Osmoregulation. Diese Region des Darms kann nach vorne zu unterziehen oder Reverse Peristaltik abhängig von dem Tier braucht.
Alexandrowicz (1909) identifizierten zwei Nervengeflechte innervieren die Krustentier Enddarm, eine innere und eine äußere Plexus Plexus, die sich später als reiche Quellen werden zur Identifizierung und Charakterisierung Neurotransmitter. In den 1950er Jahren Dr. Ernst Florey begann eine Reihe von pharmakologischen Studien über die Krebse Enddarm und gezeigt, dass Kontraktionen moduliert durch Acetylcholin und seine verwandten Verbindungen und auch von Adrenalin und Noradrenalin (Florey, 1954) sind. Florey, der Entdecker der eine hemmende Substanz bekannt als "Factor-I", untersuchten die Auswirkungen dieser Substanz auf verschiedene Präparate, darunter die GI-System in Krebsen (Florey, 1961). Factor-I wurde später gezeigt, dass GABA werden. So spielte die Krebse Enddarm eine wichtige Rolle in den frühen Studien der synaptischen Hemmung.
Nach der Entdeckung von GABA, waren andere vermeintliche Sender auch gezeigt, dass mit dem Enddarm Plexus in Verbindung gebracht werden und physiologischen Reaktionen zu entlocken. Solche Sender enthalten Dopamin (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) zwei orcokinin Peptide (NFDEIDRSGFGFN und AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) und eine myosuppressin Peptid (Mercier et al 1997;... wahrscheinlich pQDLDHVFLRFamide, vgl. Stemmler et al 2007). Jede dieser Substanzen moduliert spontane Enddarm Kontraktionen, und alle außer GABA zu sein scheinen exzitatorischen. Der Enddarm reagiert auch auf Glutamat und Quisqualat (Jones, 1962;. Wrong et al 2003), aber eindeutige Beweise für glutamatergen Innervation wurde nicht berichtet. Zelluläre Botenstoffe, die die Auswirkungen der verschiedenen Sender vermitteln, sind noch weitgehend unerforscht, aber es gibt Beweise für die Beteiligung von cAMP in Dopamin Fähigkeit, Kontraktionen (Knotz & Mercier, 1995) zu erhöhen.
Obwohl der Krebs Enddarm Verträge spontan folgende Denervierung sind solche Kontraktionen in der Regel schwach und unorganisiert (Wales, 1982; Winlow & Laverack, 1972a). Peristaltische Bewegung erfordert ein abgestimmtes Motorleistung aus dem zentralen Nervensystem, offenbar mit Ursprung in der letzten Abdominalganglion (Winlow & Laverack, 1972a, b, c). In Krebse, ist die Motorleistung auf den Enddarm durch die 7 th abdominale Wurzel, die 75 Axone, deren Zellkörper in den letzten Abdominalganglion (Kondoh & Hisada, 1986) lokalisiert enthält, durchgeführt. Zumindest einige der Peptide scheinen auf den Enddarm Plexus von Neuronen mit Ursprung in der letzten Abdominalganglion (Dircksen et al 2000..; Mercier et al 1991b; Siwicki & Bishop, 1986) geliefert werden, aber Dopamin wird durch Neuronen in mehr geliefert vorderen Ganglien (Mercier et al. 1991a). Da Motorleistung durch das 7. Abdominal Wurzel notwendig ist für große, koordinierte Kontraktionen, ist es wahrscheinlich, dass einige oder alle der vermeintlichen Sender oben aufgeführten in irgendeiner Weise die Peristaltik beitragen. Ihre relative Beiträge sind jedoch nicht bekannt. Einige Einblicke kann durch die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf die Ring-und Längsmuskeln getrennt (Mercier & Lee, 2002) gewonnen werden.
Neben der Steuerung der Bewegung der unverdauten Nahrung, erscheint das Nervengeflecht mit dem Krustentier Enddarm verbunden, um eine wichtige endokrine Funktion mit Häutung verbundenen spielen. Der Enddarm der Taschenkrebs, Carcinus maenas, enthält endokrinen Zellen, die Krebs hyperglycemic Hormon und die damit verbundenen Vorläuferpeptid Freisetzung während ecdysis (Webster et al. 2000), was auf eine Rolle in Wasseraufnahme und Schwellungen im Zusammenhang mit der Häutung. So beteiligt sich das Krustentier Enddarm in mehreren wichtigen physiologischen Prozessen.
Dieser Bericht ist in erster Linie ein Lehrmittel für fortgeschrittene Schüler und Studenten in Physiologie Kurse, die in Experimenten teilnehmen. Die Bedeutung sowie die möglichen Mechanismus hinter, wie der Enddarm Verträge und Funktionen können von den Schülern angesprochen werden. Pharmakologische Wirkstoffe, Neurotransmitter und Neurohormone wird verwendet werden, und Dosis-Wirkungs-Kurven konstruiert werden, die die Schüler, wie zu erwerben und zu interpretieren, physiologische und pharmakologische Daten zu engagieren. Ein allgemeines Verständnis der Rezeptor-Funktion im Hinblick auf Agonisten und Antagonisten können auch erreicht werden. Die Schüler lernen auch, um Daten in grafischer Form zur statistischen Analyse zu präsentieren.
Es ist sehr leicht zu zerlegen und aufzeichnen Kontraktionen aus der Krebse Enddarm. In der sezierten Vorbereitung, ist der Darm leicht an körperfremde Substanzen ausgesetzt. Die Veränderung in peristaltische Aktivität kann visuell oder mit einem Kraftaufnehmer, die auch überwachen kann die Kraft der Kontraktionen beobachtet werden. Aufgrund seiner Einfachheit und Zuverlässigkeit als Bioassay Vorbereitung ist die Krebse Enddarm noch sehr nützlich für die Untersuchung von vielen Fragestellungen über die Mechanismen der Peristaltik, Modulation der Motorleistung und der Muskelkontraktion und-Rezeptor-Funktion. Der Enddarm ist auch für die Prüfung Insektizide, crustaceancides und Schadstoffe, für spezifische Mechanismen der Aktionen nützlich.
2. Methoden
2,1) Materialien
- Flusskrebs
- Krebse Kochsalzlösung
- Dissektion Instrumente (Grob-und einer feinen Schere, grob & feinen Pinzette)
- Sylgard-Talsohle Petrischale
- Stahl Sezieren Pins
- Becher (gegenüber chemischen Lösungen halten)
- Parafilm (zum Abdecken & Mischen von Lösungen)
2,2) Dissection
- Crayfish (Procambarus clarkii) messen 6-10 cm in Körperlänge sollte auf Eis 5 bis 10 Minuten gegeben werden, um das Tier zu betäuben, bevor Dissektion beginnt.
- Halten Sie den narkotisierten Krebse hinter den Klauen mit einer Hand. Schnell, aus der Augenhöhle in die Mitte des Kopfes auf beiden Seiten abgeschnitten, und dann enthaupten die Krebse (Anmerkung: das Blut aus der Vorbereitung wird klebrig sein, wenn es trocknet, so waschen Sie die Werkzeuge, wenn abgeschlossen).
Abbildung 1: Enthauptung von Flusskrebsen - Schneiden Sie die chelipeds und Laufbeinen.
- Schneiden Sie den linken und rechten Heckflossen, nur Verlassen der Mitte Heckflosse (uropod).
- Auf der Rückenseite des Krebses Schnitt ventral an der linken und rechten Seite des dorsalen Kutikula.
Abbildung 2: Entfernen von Dorsal Cuticle - Cut quer auf der Rückenseite der Kutikula, um sicherzustellen, dass der Schnitt flach, um Schäden an der GI verhindern Dann entfernen Sie den unteren Abschnitt der dorsalen Bauch-Kutikula.
- Setzen Sie den sezierten Krebse in einen Sylgard gesäumten Gericht.
- Pin die Krebse, die Schüssel an der Spitze der Heckflosse. Man kann mehrere Stifte auf beiden Seiten der GI als notwendig, um den Körper gedrückt.
- Füllen Sie die Schale mit Flusskrebsen Kochsalzlösung für den GI Achten Sie darauf, immer wieder übergießen GI mit Kochsalzlösung mit einer Pipette. Saline ist eine modifizierte Van Harreveld-Lösung (1936), die mit 205 mM NaCl hergestellt wird, 5,3 mM KCl; 13,5 mm CaCl 2 · 2H 2 O, 2,45 mm MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES und auf pH 7,4 eingestellt. Die seziert Krebse sollte wie in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 3: Dissected Flusskrebse mit GI intakt.
2,3) Experimente
2.3.1) Kontraktionen in der Tier-
- Haben Lösungen der zu testenden Verbindung bereit und bei der gleichen Temperatur wie die Bade-Kochsalzlösung. Am vielleicht nutzen individuelle Lösungen von Serotonin (100 nM, 1microM), Glutamat (1microM) und Dopamin (1microM) in Flusskrebse Kochsalzlösung als Ausgangspunkt zu testenden Substanzen hergestellt.
- Lassen Sie den sezierten Krebse in die Krebse Lösung für ca. 10 Minuten sitzen, damit sie den Schock der Dissektion und Kochsalzlösung Belichtung einzustellen. Die langsame Peristaltik Kontraktionen aus dem Enddarm beginnen sollte, auftreten.
- Sobald die Wehen beginnen, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die in 30 Sekunden (man beachte die Art der Kontraktionen, die auftreten, dh die Peristaltik Typ oder spastische, und die Richtung einer peristaltischen Wellen) auftreten.
Tabelle 1: Die Kontraktionen in Crayfish SalineAnzahl der Kontraktionen Art der Kontraktionen - Mit Hilfe eines piPette, entfernen Sie die Salzlösung in den Hohlraum der Krebse ist ausgesetzt Bauch, und wenden Salzlösung, die die Substanz direkt auf den Enddarm untersucht werden.
- Unmittelbar nach Zugabe der Lösung, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die nach 30 Sekunden auftreten und notieren Sie die Art der Kontraktionen, (dh peristaltische oder spastische) auftreten.
Tabelle 2: Die Kontraktionen mit der Exposition gegenüber VerbindungenCompound getestet Konzentration Anzahl der Kontraktionen Art der Kontraktionen - Unmittelbar nach der Aufnahme die Reaktion auf die Testsubstanz, spülen Sie die GI mehrmals mit normalen Krebse Kochsalzlösung. Lassen Sie die Vorbereitung für 5 Minuten stehen lassen, während Spülen etwa alle 30 Sekunden mit Flusskrebsen Kochsalzlösung.
- Mit einer Pipette Ort einige Kochsalzlösung mit der nächsten Verbindung zu prüfende oder ein abwechslungsreiches Konzentration der letzten Substanz getestet direkt auf den Enddarm. Am besten ist es mit einer geringeren Konzentration und Arbeit seinen Weg zu höheren Konzentrationen zu starten.
- Unmittelbar nach Zugabe von jedem neuen Stoff oder jede neue Konzentration, notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen, die nach 30 Sekunden auftreten und notieren Sie die Art der Kontraktionen.
2.3.2) Recording Kräfte der Kontraktion in herausgeschnitten Vorbereitungen
Abbildung 4: Setup
- Bringen Sie den Schwinger an der Brücke pod.
- Bringen Sie die Brücke pod auf die PowerLab 26T.
- Bringen Sie die PowerLab 26T an den USB-Anschluss am Computer.
- Öffnen LabChart7, indem Sie auf den labchart7 Symbol auf dem Desktop.
- Die LabChart Welcome Center-Box öffnet sich. Schließen Sie es.
- Klicken Sie auf Setup
- Klicken Sie auf Kanaleinstellungen. Ändern Sie die Anzahl der Kanäle auf 1 (unten Kasten links) drücken OK.
- An der oberen linken Ecke des Diagramms stellen Sie den Zyklen pro Sekunde bis etwa 2k. Setzen Sie den Volt (y-Achse) bis etwa 500 oder 200 mV.
- Klicken Sie auf Kanal 1 auf der rechten Seite des Diagramms. Klicken Sie auf Eingang Verstärker. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen: single-ended, AC-gekoppelt, und (invertiert das Signal bei Bedarf), Invertzucker und Anti-Aliasing, werden überprüft.
- Um die Aufnahme zu starten drücken beginnen.
- Pick-up der Vorbereitung und schneiden Sie die GI-Trakt an der Nahtstelle zwischen dem Brustkorb und den Bauch. Dann vorsichtig um die telson Teil der Schwanz abgeschnitten. Nehmen Sie die GI-Trakt aus dem seziert Krebse und legen Sie sie in die Sylgard Gericht. Es ist ein Blutgefäß, das entlang der Dorsalseite des GI-Trakt führt. Ziehen Sie diese von der GI-Trakt. Füllen Sie frische Krebse Kochsalzlösung auf die Vorbereitung.
- Legen Sie die Kraftaufnehmer in die Klemme in der Nähe des seziert Krebse.
- Haken Sie die Kraftaufnehmer in die Krebse GI wie in Abbildung 5 dargestellt.
Abbildung 5: Isolierte Enddarm des Krebses in Kochsalzlösung an den Haken des Kraftaufnehmers - Warten Sie, bis die GI beginnt zu kontrahieren, und drücken Sie Start auf dem LabChart7.
- Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie "Stop", und fügen Sie einen Kommentar gekennzeichnet, "Saline only". Füllen Sie das Tabelle 4.
Tabelle 4: Die Kontraktionen mit der Verbindung von InteresseAnzahl der Kontraktionen Amplitude der Kontraktionen (mV) - Fügen Sie die Test-Verbindungen von Interesse, und sofort push "start" auf dem LabChart7.
- Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie "Stop" und fügen Sie einen Kommentar direkt im Diagramm-Datei, welche Substanz zugegeben und die Konzentration. Füllen Sie das untenstehende Tabelle.
Tabelle 5: Die Kontraktionen mit _________ VerbindungAnzahl der Kontraktionen Amplitude der Kontraktionen (mV) - Spülen Sie das Präparat mit Flusskrebsen Kochsalzlösung mit einer Pipette.
- Fügen Sie andere Stoffe oder verschiedenen Konzentrationen in einer ähnlichen Weise. Unmittelbar push "start" auf dem LabChart7.
- Lassen Sie das Programm für etwa 20 Sekunden laufen. Drücken Sie "Stop", und fügen Sie einen Kommentar und Label direkt auf den Diagramm-Datei unter Angabe der compound verwendet und die Konzentration.
3. Data Analysis
- Von 2.3.1 des Experiments, Grafik die Anzahl der Kontraktionen aus jeder Lösung (Kochsalzlösung, Serotonin, Glutamat) gegen die Zeit. Erklären Sie keine Trends.
- Von 2.3.2 des Experiments, Grafik die Anzahl der Kontraktionen aus jeder Lösung (Kochsalzlösung, Serotonin, Glutamat) vs die Amplitude der Kontraktionen in mV. Erklären Sie keine Trends.
3,1) messen die Geschwindigkeit und Kraft der Kontraktionen
Zur Index der Preise von Kontraktionen auf die Zeit vom Beginn an einer Biegung an den Anfang des nächsten Taktes oder zählen die insgesamt Ausschläge über ein oder zwei Minuten. Die Werte können dann in Form von Kontraktionen pro Minute oder pro Sekunde, je nachdem wie schnell sie auftreten gestellt werden.
Zur Index die Kraft der Kontraktionen ein relatives Maß verwendet werden, um unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen. Auf die gespeicherte Datei kann man mit der Markierung "M" und bewegen Sie auf die Grundlinie. Dann nutzen Sie den Cursor und auf den Gipfel der Ablenkung bewegen und nehmen den Wert in der oberen rechten Ecke des Bildschirms als Delta-Wert (die Differenz von M bis zum Gipfel) notiert. Beachten Sie den Cursor muss stationär gehalten für das Maß der Veränderung werden. Dann bewegen Sie die M auf der nächsten Welle Form von Zinsen und wiederholen Sie die Messung.
Discussion
Die Angaben in den zugehörigen Film und Text versehen beschreiben die wichtigsten Schritte, um die Aktivität in den Enddarm des Krebses in situ sowie in vitro aufzunehmen. Ein Ziel unseres Berichts ist es, das Bewusstsein für das Potenzial dieses Präparats Anstieg der Studierendenzahlen-run investigative Labors, die grundlegende Konzepte in Physiologie und Pharmakologie zu lehren.
Diese Zubereitungen können verwendet werden, um eine Reihe von experimentellen Fragen, die zu einem besseren Verständnis der physiologischen Funktionen der Enddarm führt zu untersuchen. Die zugrunde liegenden Mechanismen Regulierung der peristaltischen Wellen und ihre Umkehrung sind noch nicht bekannt. Die Mechanismen, die für eine höhere Kontrolle über den gesamten GI-Trakt sind auch nicht vollständig verstanden. Die Frage, wie höheren Zentren integrieren ihre Tätigkeit mit dem autonomen Ausgang, der direkt den GI-System bleibt eine offene Fläche von Ermittlungen (Shuranova et al., 2006). Darüber hinaus haben die osmoregulatorische Fähigkeiten des Krustentier Enddarm und die Funktionen der Osmoregulation während der Mauser und Umweltbelastungen nicht vollständig geklärt. Es gibt immer noch viele Fragen warten auf Antworten in dieser Zubereitung.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Unterstützt von der University of Kentucky, Department of Biology, Office of Undergraduate Studies and College of Arts & Sciences.
Materials
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References
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