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Immunology and Infection

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

doi: 10.3791/2365 Published: January 3, 2011

Summary

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을 보여줍니다

Abstract

antimalarial 약물에 대한 응답과 말라리아 기생충의 pathogenicity의 변화는 생물 학적 및 의료 중요하다. 연계 매핑 1-3 설치류와 인간의 4-6 말라리아 기생충의 다양한 특성을 기본 유전자 또는 loci 성공적으로 확인되었다. 말라리아 기생충 Plasmodium yoelii 야생 아프리카 설치류로부터 분리된 많은 말라리아 종 중 하나이며 실험실에서 성장에 적응되었습니다. 이 종족은 인간의 말라리아 기생충의 생물 학적 특성 중 많은 것들을 재현한, 같은 microsatellite 및 증폭 단편의 길이 다형성 (AFLP) 마커와 같은 유전자 마커 또한 기생충 7-9 위해 개발되었습니다. 따라서, 쥐 말라리아 기생충의 유전자 연구는 Plasmodium falciparum에 대한 연구를 보완하기 위해 수행할 수 있습니다. 여기, 우리는 P.의 유전 십자가를 생산을위한 기술을 보여줍니다 첫째 DRS에 의해 개척되었다 yoelii. 데이비드 Walliker, 리차드 카터와 에딘버러 (Edinburgh) 10 대학에서 동료.

P.의 유전 십자가 yoelii 및 기타 설치류의 말라리아 기생충은 관심의 phenotypes와 모기가 사일 감염 후 감염된 생쥐에서 피드 수에 따라 다릅니다 두 유전자 별개의 클론의 gametocytes를 포함 inoculum와 쥐 뮤스의 musculus를 감염에 의해 실시하고 있습니다. 마우스 혈액에서 남성과 여성 gametocytes의 존재는 미세 이송하기 전에 확인합니다. 수유 후 48 시간 이내에 모기의 midgut에서 haploid gametocytes은 남성과 여성의 gametes에 차별 비옥하고, diploid의 접합자 (그림 1) 형태. ookinete에 접합자의 개발 과정, 감수 분열 11 발생 나타납니다. 접합자는 두 유전자 별개의 기생충, 유전자 교류 (. 상동 염색체의 쌍 비 자매 chromatids 사이의 염색체 reassortment 상호 오버, 그림 2) gametes 사이의 교차 수정을 통해 파생하는 경우는 재조합의 결과가 발생할 수 있습니다 동종 loci에서 유전 물질. 각 접합자 네 haploid의 핵 이어지는 두 개의 연속 핵 분열을 겪습. ookinete 추가 oocyst으로 개발하고 있습니다. oocyst가 성숙되면, sporozoites (십자가의 자손)의 수천이 형성 및 모기 hemoceal로 출시됩니다. Sporozoites는 침샘에서 수확 및 사전 erythrocytic 및 erythrocytic 단계 개발이 이루어지는 새로운 murine 호스트로 주입됩니다. Erythrocytic 양식은 복제와 유전 결합 매핑하기 전에 부모의 라인을 구분 문자에 관한 분류됩니다. 개별 부모 클론 제어 감염은 유전 십자가의 생산과 같은 방식으로 수행됩니다.

Protocol

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무균 기술은 실험 결과를 혼란시킬 수있는 마우스로 외인성 감염 요원의 실수로 도입을 피하기 위해 동물로 administrated 될 모든 재료에 적용해야합니다.

1. 피를 단계 말라리아 기생충과 실험실 쥐를 감염

  1. 상온에서, 냉동 혈액 단계 말라리아 기생충을 포함하는 두 병이 깨지는 해동. 이 예제에서 사용이 쥐 말라리아 기생충의 종자는 Plasmodium yoelii yoeliiPlasmodium yoelii의 nigeriensis입니다.
  2. 22-30 게이지 (G) 바늘로 주사를 맞게하고 살균, 제약 학년 PBS (산도 7.4) 400 μL를 그립니다.
  3. 내용이 homogenously 혼합 때까지 주사기를 반전 아래, 같은 주사기를 사용하여 해동 감염된 혈액 100 μL를 그립니다. (옵션 : 피펫이 주사 주사기로 전송하기 전에 컬렉션 튜브에 PBS 및 감염된 혈액을 전송하는 데 사용할 수 있습니다.)
  4. 기생충이 직접 마우스 복막에 솔루션을 포함하는 200 μL를 주입. 완료되면, 샵스 빈의 주사기를 폐기하십시오. (또한 실험실 마우스의 유지 관리에 대한 보충 자료를 참조). 일반적으로 inoculum의 표준 크기가 원래 냉동 자료에 기생충 감염의 수준에 따라, 100-500 μL 사이입니다.
  5. 이 마우스 각으로 교차하는 두 기생충의 변종을 주사. 생쥐는 주사 후 미세 3-5일 긍정하게 될 것입니다. parasitemias가 1~5% 사이에 도달하면 다음 단계로 진행합니다.

2. 마우스의 혼합 클론 감염

  1. 사전 혼합 복제 감염으로, Giemsa 스테인드 얇은 피묻은 얼룩에 의해 현미경 검사 (그림 3)에 대한 다른 기생충의 변종에 감염된 두 기증 마우스의 꼬리 혈액을 수집하고, 적혈구 세포 밀도의 측정 (세부 절차에 대한 보충 자료를 참조) .
  2. 이전 얻은 parasitemia 붉은 혈액 세포 밀도 측정을 사용하여 생리 식염수 (1.5 % W / V trisodium의 구연 산염 이수화물, 0.85 % W / V 나트륨 염화물) 및 inoculum 혼합물을 생산하는 데 필요한 마우스 혈액의 볼륨을 계산합니다.
  3. 100μl 당 백만 감염된 적혈구의 최종 농도에 기생충 솔루션을 조정합니다.
  4. 혼합 복제 inoculum를 얻기 위해 1:1 비율에서 두 기증자로부터 감염된 혈액을 결합합니다. 두 부모의 클론이 성장 속도에 차이가하면,의 비율을 조정 1시 2분 또는 1시 5분에 느린 성장하는 부모 복제 부모의 빠른 성장.
  5. 감염 각 마우스의 복막에 혼합 시료 100 μL를 주입. (주입하는 생쥐의 수를 결정하기 위해 3.9 단계도 참조)
  6. 이 방법을 사용하여 단일 부모 변종 각이 쥐를 감염. 단일 클론 감염은 두 부모 변종을 성공적으로 전송 결정을하실 수 있습니다.

3. 수유 모기

  1. 300-500 성인 (남성과 여성) 아노 펠 레스 모기 stephensi 각 pupae에서 세 5-7일 게시물의 출현을 포함하는 세 새장을 준비합니다. 용기는 플라스틱이나 금속 뚜껑에 의해 안전 그물로 덮여있다. 두 케이지는 부모의 클론에 이송되며 세 번째 케이지는 유전 십자가의 준비입니다.
  2. 혼합 복제 감염 후 사일 시작 감염된 생쥐에서 Giemsa - 스테인드 얇은 혈액 꼬리 얼룩을 준비합니다.
  3. 1000x 확대 최소한 50 미세한 필드를 검사하여 현미경으로 얼룩을 검사하고 남성과 여성의 gametocytes 존재 여부를 결정합니다.
  4. 남성과 여성 gametocytes 큰 공포 대형 과립의 존재 (그림 3)에 의해 인식할 수 있습니다. 남성과 여성 gametocytes는 각각, 핑크, 파랑 세포질 있습니다. gametocytes가 존재하는 경우, 3.6 단계 따르십시오.
  5. gametocytes이 결석하는 경우, 그들이 나타날 때까지 매일 계속 모니터링. gametocytes가 존재하는 경우 다음 단계를 계속합니다.
  6. 마취제와 3 각 감염된 마우스 (20g 마우스 체중 당) 마취에 마우스 복막에 MG / xylazine의 ML 33 MG / ML을 포함한 마취 약물 칵테일 50 μL를 주입. 마취제와 xylazine의 최종 선량은 각각 82.5 및 7.5 MG / kg이다.
  7. 쥐들이 24 시간을위한 설탕 공급 부족과 모기가 중단없이 30 분 동안 먹을 수있게되었습니다 성인 아노 펠 레스 모기 stephensi을 포함 새장 위에 엎드려서 얼굴을 넣습니다.
  8. 표준 조건 (; 또한 실험실 모기의 유지 관리에 대한 보충 방법을 참조하십시오 온도가 24-26 사이에 유지 ° C)을 아래 insectary에서 모기를 유지합니다.
  9. 모든 50-100 여성 모기 한 감염된 마우스를 사용합니다. 쥐가 마취하에 계속하는 동안 수유 후 자궁 전위에 의해 즉시 쥐를 안락사.

4. 해부 모스키토 MidgUTS 카운트 Oocysts

  1. 9 일 먹이 후, 모기는 곤충의 midgut에서 oocysts에 대해 검사됩니다. 단일 클론 감염된 생쥐에 피드가 두 부모 변종의 gametocytes을 나타냅니다 모기에 oocysts의 존재는 전염성이 있습니다.
  2. 모기 midgut을 해부하다하려면, 새장 5-10 감염된 모기를 수집하는 작은 컨테이너에 연결된 흡인기를 사용합니다.
  3. CO 2 가스를 사용하여 모기를 마취하고 얼음에 유리 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 별도의 남성 모기를 폐기하십시오. 남성의 안테나는 암컷에 비해 눈에 띄게 bushier 있습니다.
  4. PBS 두 주사기를 작성, 26 게이지 절반 인치 (G ½) 바늘과 함께 그들을 맞습니다. 유리 슬라이드에 주사기에서 PBS 100 μL에 대한 보증금.
  5. PBS의 드롭에 5-10 anesthetized 여성 모기를 전송하고 해부 현미경에서 슬라이드를 놓으십시오.
  6. 같은 바늘을 사용하면, 흉부 및 복부 뒷부분에서 곤충을 잡고, 다음 각 모기의 날개와 다리를 제거 midgut, 흰 색 같은 몸, 발표 때까지 분리 시체를 가져옵니다. midgut를 분리하고 신체의 나머지 부분을 삭제.
  7. 슬라이드가 건조하는 경우 midgut에 대한 자세한 PBS를 추가합니다. 건조 해주면 midgut이 타락한 것이다. midguts 통해 커버 전표를 놓습니다.
  8. 100x 확대에 가벼운 현미경 midguts을 검사합니다. (그림 3) 각 midgut에서 oocysts의 숫자를 세어보세요. Oocysts은 midguts의 바깥쪽 표면에 거짓말 두꺼운 벽 원형 구조로 인식할 수 있습니다.
  9. 완료되면, 주사기, 주사 바늘 및 샵스 빈의 슬라이드의 폐기.
  10. oocysts이 midguts에 부재중인 경우, gametocytes의 높은 숫자에 감염된 쥐 모기 먹이를하고 이상 수유 시간을 제공합니다. 온도는이 단계에 중요합니다. 온도가 24-26 ° C.에 설정되어 있는지 확인

5. 원심 분리에 의해 모기 Sporozoites 모집

  1. 다음과 같이 sporozoite 수집 튜브를 준비 : 깨끗이 0.5 - ML의 원심 분리기 튜브의 뚜껑을 잘라 골조 19 G 바늘을 사용하여 튜브의 하단에있는 구멍 (0.1-0.2 mm 직경)를 펀치.
  2. 글라스 울로 튜브의 1 / 3을 입력합니다. (한 관 ~ 100 모기에서 수확 sporozoites 충분합니다) 1.5 - ML 수집 관에 필터 튜브를 삽입
  3. 17 일 게시물 먹이에서 흡인기를 사용하여 작은 용기에 케이지에서 모기 (4 단계)를 수집합니다.
  4. 모기를 마취하는 CO 2 가스를 사용합니다.
  5. 남성 모기의 암컷을 분리. 컨테이너에서 얼음에 유리 페트리 접시에 anesthetized 여성 모기를 전송합니다.
  6. PBS로 가득한 26 G의 ½ 잎 두 개의 주사기를 준비합니다. 유리 슬라이드에 주사기에서 PBS 100 μL에 대한 보증금.
  7. 현미경 슬라이드에 모기를 전송합니다. 해부 현미경 모기 '머리, 날개, 다리와 복부를 제거합니다.
  8. 세부적으로 밀고 집게를 사용하면 1.5 ML 균질 화기 (박격포와 유봉)에서 0.5 ML PBS로 thoraxes를 전송합니다. (sporozoite 2-3 H에 대한 infective 유지) 얼음 thoraxes을 저장합니다.
  9. (그림 3 참조) 침샘에서 sporozoites를 공개 얼음 thoraxes을 균질하고, 유리 피펫을 사용하여 글라스 울 (단계 5.1-5.2)로 채워진 튜브에 lysates을 (homogenates) 전송.
  10. 상온에서 1,000 rpm으로 10-20 초위한 원심 분리기.
  11. 수집 흐름 -을 통해 (정화의 sporozoite 서스펜션)가 22-30 G의 바늘로 주사를 사용합니다. (옵션 : 드롭 흐름을 통해 미세한 슬라이드에 커버가 표준 가벼운 현미경, 400X 배율에서 살고 sporozoites를 실수로 시각화 장소도 참조 그림 3 10-50 μL)
  12. 마우스 (; 심판이 12 참조 최대 200,000 기생충이 단일 모기에서 수확 가능)로 sporozoite 정지의 IP 0.1-0.5 ML을 주사. 성공적인 경우에, 동물은 주사 후 72 시간을 감염 될 것입니다.

6. 제한 희석을 사용하여 복제 프로 제니

  1. sporozoite 주사 후 72 시간이 얇은 피묻은 얼룩의 Giemsa의 얼룩 후 적혈구 세포 밀도의 측정 현미경 검사에 대한 다른 기생충의 변종 (자세한 절차를 보려면 보충 자료 참조)에 감염된 두 기증 마우스의 꼬리 혈액을 수집합니다.
  2. 0.1-1 %의 parasitemia을 표시 마우스를 선택하고 그의 감염된 적혈구가 복제 절차 기증자로서 주로 단일 기생충을 포함하고 있습니다. 생쥐가 미세하게 부정하는 경우 6.1 일 다음 단계를 반복합니다. 동물이 14 일 이내에 감염되지 않는 경우) 5 단계 중 2 단계를 반복하고 단계 5.11에서 sporozoites의 존재를 결정합니다.
  3. 송아지 혈청과 포유 동물 링어의 솔루션 (2.7 MM의 칼륨 염화물, 1.8 MM의 염화칼슘, 154 MM의 나트륨 염화물)의 차가운 1시 1분 솔루션에 수확 꼬리 혈액을 희석해서로 죄수를 달성하기 위해한 감염된 적혈구 100 μL 당 세포, 그리고 얼음에 inoculum를 저장할 0.6의 centration. 이러한 방법으로 개인 마우스의 대부분은 하나 또는 제로 기생충 중 하나를 받으실 수 있습니다.
  4. 정맥 50-100 생쥐의 각 희석 감염된 혈액 100 μL를 주입.
  5. 5 ~ 7 일 후, Giemsa - 스테인드 얇은 피묻은 얼룩을 검사하여 혈액 무대 기생충의 존재에 대한 쥐를 화면. 성공적인 실험에서 생쥐의 20~50%가 감염되어 8 일 이후 감염에서 0.1-5.0 %의 parasitemia를 표시합니다.

7. 유전자 표식을 사용하는 제니의 특성화

  1. 냉장 생리학 구연 산염 생리 식염수, 소용돌이 짧게, 그리고 펠렛 혈액 세포로 상온에서 3,000 rpm으로 3 분위한 원심 분리기의 0.2 ML를 포함하는 1.5 - ML의 microcentrifuge 관에서 마우스 꼬리 피가 20-40 μL를 수집합니다. 바로 DNA를 추출하거나 -80시 펠렛 ° C. 유지
  2. 표준 DNA 추출 방법을 사용 기생충 DNA를 준비합니다. DNA의 급속한 분리 들어, 높은 순수 PCR 템플릿을 준비 키트 (로체 응용 Bioscience)를 사용합니다.
  3. 재조합 자손은 microsatellite (MS) 또​​는 유전 십자가의 두 부모의 변종을 차별화 할 수 서로 다른 염색체에있는 단일 염기 다형성 (SNP)를 사용하여 genotyping 후 확인할 수 있습니다. P. MS의 genotyping을위한 단일 형광 라벨이 표시된 primers를 사용하는 단순 방법 yoelii는 (심판이 8,9 참조) 사용할 수 있습니다.

8. 피를 단계 말라리아 기생충의 Cryopreservation

  1. 50-10 ML의 50~20%의 parasitemia와 anesthetized 마우스 심장 주사에 의해 감염된 혈액의 0.5-1 ML 수집은 생리 생리 식염수를 차게.
  2. 상온에서 2,000 rpm으로 5 분 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오.
  3. 혈액 알약에 Glycerolyte 57 솔루션 드롭 현명한 2X 볼륨 (Fenwal 연구소)을 추가하고 잘 섞는다.
  4. cryotubes (튜브 당 0.2-0.5 ML)에 정지를 전송합니다.
  5. -80 ° C (최대 1 월) 또는 액체 질소에 cryopreserved 혈액을 저장합니다.

9. 대표 결과 :

성공적인 실험에서 복제된 라인 50~10% 독립 재조합 자손 것입니다.

그림 1
그림 1. 유전자 교차하는 동안 가족 생활주기와 유전자 재조합 이벤트 도식 표현. 유전자 재조합 이벤트 모기의 발전의 초기 단계에서 이루어집니다. 모기의 midgut 다른 유전 배경을 "haploid"남성과 여성 gametes의 수정에 따라, "diploid"zygotes가 형성됩니다. 접합자는 기생충의 생활주기의 유일한 diploid 단계를 구성, 감수 분열은 수정 12 시간 이내에 다음과 모기와 포유류의 모든 후속 단계가 haploid 남아있다. 결과 zygotes는 ookinetes 및 oocysts으로 개발합니다. 각 oocyst의 성장과 mitotic 사업부는 모기 'hemoceal에 출시되는 sporozoites 수천을 생산하고 있습니다. 침샘으로 마이 그 레이션하는 사람 sporozoites는 간과 적혈구 세포 단계의 개발이 이루어지는 포유류의 호스트로 전송하는 위치에 있습니다. 붉은 혈액 세포주기의 과정에서, 몇몇 기생충은 성숙한 남성과 여성의 gametocytes로 구별하실 수 있습니다. 이러한 gametocytes 다른 모기, 영속 전송에 의해 촬영 때 기생충의 생활주기가 완료되었습니다.

그림 2
그림 2. 말라리아 기생충 및 재조합 자손의 생산에 핵 유전자의 상속. 유전자 재조합은 염색체 reassortment이나 크로스 오버 이벤트에 의해 생성하실 수 있습니다. Homozygous 자손 같은 부모 클론 1 개 또는 2 개 (A와 D), 각각의 gametes 사이 selfing에 의해 생산. B) 두 개의 다른 부모 클론 혼자 염색체 reassortment에 의해 형성되는 재조합 핵 (블루 타원)의 gametes 사이의 교차 수정에 의해 만들어진 Heterozygous 자손. C) 상동 염색체의 비 자매 chromatids 사이 crossovers에 의해 형성되는 두 개의 다른 부모 클론, 재조합 핵 (적색 타원)의 gametes 사이의 교차 수정에서 생산 Heterozygous 자손.

그림 3
그림 3. 설치류 말라리아 기생충 Plasmodium yoelii의 형태론. 10 일째 게시물 oocysts와) 링 단계, B) trophozoite, C) schizont, D) merozoites, E) 미숙한 남성 gametocyte, F) 성숙 남성 gametocyte, G) 미숙한 여성 gametocyte, H) 성숙 여성 gametocyte 전) midgut 먹이 (화살표로 표시 성숙 oocysts, 200x 배율), J) 모기 침샘 (100x 배율), K) sporozoites (400x 배율).

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Discussion

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우리는 또한 다른 쥐 malarias의 유전 십자가의 생산에 적용되는 설치류 말라리아 Plasmodium yoelii에서 유전자 십자가의 생산을위한 기술을 보여줍니다. 단일 클론 부모와 생쥐의 감염은 대개 부모가 십자가를 수행하기 전에 기능 gametes를 생산 능력이 있는지 확인하는 부모 기생충의 성공적인 전송을 결정하기 위해 수행됩니다.

모기를 통해 성공적인 전송이 insectary의 온도, 사용 쥐 말라리아 기생충의 종, 그리고 혈액 무대 기생충의 복용 (inoculum 크기)를 포함한 여러 요인에 의해 영향을받습니다. P. berghei의 전송은 보통 19-21 ° C 13, P.의 전송에 달성되는 동안 yoelii와 P. chabaudi는 정기적으로 23-25 ​​° C 14에서 수행됩니다. P.의 Ookinetes berghei은 온도에서 oocysts로 발전하지 않는 16보다 낮은 ° C 또는 24 ° C보다 높은 15. 온도 이외에, inoculum 크기는 혈액에서 말라리아 기생충의 증식 속도에 영향을 미칠 수있다. 대형 inoculum 크기의 주사는 (5 × 10 6 iRBC 이상) 감염의 아주 초기 단계에서 높은 parasitemia을 낼 수 있지만, 반드시 gametocytes 또는 모기에 더 높은 감염의 더 큰 숫자로 이어질하지 않습니다. 개즈비 및 기타 (2009) 16 P. chabaudi adami의 gametocytes은 일 20 3 일 (일 13 피크)에서 혈액에 iRBC 1 × 10 6 게시물 감염 존재하는 것으로 나타났다 있지만, 6 일 포스트 감염 전용입니다 일시 어떤 모기가 감염된다. 또한, 이러한 클론 N67 (nigeriensis), 17XL, 그리고 P. yoelii의 YM, P.의 클론 앙카로 빠르게 성장하는 및 악성 기생충의 변종의 큰 inoculum의 크기 관리 berghei, 그리고 P. chabaudi adami의 클론 DS는 종종 마우스 체온의 상당한 저하를 일으킬 수 있습니다 생쥐에 심한 빈혈과 병리에 발생합니다. 그 결과로, 마우스는 모기에 덜 infective (관찰되지 않은)이된다. 그럼에도 불구하고, 쥐 말라리아 기생충의 전송 표준 inoculum 크기 (10 6 iRBC)로 실시되었습니다. 그것은 발견되었다는 P. berghei와 P. P. chabaudi chabaudi 및 P. chabaudi adami 쥐 16, 18 혈액 무대 유도된 감염 후 6 일 모기에게만 보낼 수있는 반면 yoelii은17 혈액 무대 유도된 감염 후 5 일 3에서 모기로 보낼 수있는 수 있습니다.

재조합 자손의 생산에 영향을 미치는 요인은 생쥐에 두 부모 변종의 gametocytes의 비율을 포함합니다. 이론적으로, 재조합 자손의 최대 생산 부모 클론의 두 남녀 gametocytes가 같은 수가 있으며 자기 수정 및 상호 수정이 동일한 주파수에서 발생하는 경우에 발생합니다. 이 조건에서 결과 zygotes의 절반 하이브리드되며 나머지 두 부모 복제 라인의 동일한 비율로 구성됩니다. gametocytes의 비율이 자체 수정 disproportional로 이어지는 하나의 부모 클론 대한 편견 때 재조합 자손의 클론 제작을 획기적으로 줄일 수 있습니다. 또한, 기생충은 종종 다른 성장률을 가지고 있고 gametocytes 16, 19 생산에서 다른 기능을 할 수 있습니다. 따라서 모기 먹이에 대한 생쥐에 주입하는 혼합물의 부모 기생충의 비율을 최적화하는 것이 필요합니다.

모기가 수유 후에 혈액에서 기생충을 복제하는 데 걸리는 시간도 고려해야 할 중요한 요소이다. 그것은 parasitemia가 복제 클론 중복을 피하기 위해 0.1-1.0 % (혈액에 너무 많은 복제 사이클 전) 사이에 때 유전 십자가의 자손을 복제하는 것이 바람직합니다. 빠른 또는 느린 성장 기생충은 시간의 특정 기간에 큰 숫자가 나올 수 있으며, 빠른 또는 느린 성장 기생충의 봉우리에서 복제 같은 phenotypes 발생 클론와 종료됩니다.

결론적으로, 쥐 말라리아 기생충을 사용하여 유전자 교차를 수행하는 것은 쉬운 상대와 인간의 말라리아 기생충 P.의 유전자 교차를 수행하는 것보다 훨씬 저렴합니다 nonhuman 영장류의 감염을 필요로 falciparum. 유전자 재조합 십자가의 자손은 유전 결합지도의 건설 및 기생충 개발, 약제 내성 및 독성을 포함하여 중요한 말라리아 특성의 매핑을위한 유용한 도구입니다.

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Disclosures

저자는 공무원이며, 이것은 정부의 작품이기 때문에 작품은 미국에서 이미 공개 도메인에 있습니다. 다른 계약에도 불구하고, NIH는 표시 PubMedCentral에 작품을 제공하고 대중 사용할 수있는 권리를 보유하고 PubMedCentral는 관습 관행과 일치 작업을 태그 또는 수정하실 수 있습니다. 당신은 정부가 사용 라이센스에 따라 미국 이외의 권한을 설정할 수 있습니다.

Acknowledgments

우리는 원고의 중요한 읽기위한 DRS 랜디 엘킨스, 로빈 Kastenmayer, 테드 토리, 댄 정지 및 Tovi 리먼 감사드립니다. 이 작품은 교내 연구 부문의 교내 연구 프로그램, 알레르기 및 전염병, 보건 국립 연구소 국립 연구소에 의해 중국의 973 국가 기초 연구 프로그램, # 2007CB513103에 의해 지원되었다. 우리는 도움을 NIAID 교내 편집기 브렌다 라에 마샬 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glyerolyte 57 solution Cenmed 4A7833
Mouse Mus musculus Charles River Laboratories Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum Invitrogen 26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution Invitrogen 10010-072 pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1) MR4 MRA-593 deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67 MR4 MRA-427 deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi MR4 MRA-128 deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer Nexcelom Bioscience Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit Roche Group 11 796 828 001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich GS500
Ketamine hydrochloride Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S4641
Xylazine Akorn Inc 4811-20ml Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool VWR international 32848-003
Glass capillary (1 μL) VWR international 53440-001
Hemocytometer VWR international 15170-168 Complete chamber set
Homogenizer VWR international KT749520-0090 Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

  • Maintenance of laboratory mice
  • Maintenance of laboratory mosquit–s
  • Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
  • Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquit–s

Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.

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References

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쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜
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Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).More

Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).

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