マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ
Summary
アッセイは、細菌および真菌の早期のバイオフィルム形成を測定する迅速な手段を説明します。このメソッドは、微生物のバイオフィルム形成のための基層としてのマイクロタイタープレートを使用し、バイオフィルムは、クリスタルバイオレットの菌株を用いて可視化です。アッセイは、どちらかの初期のバイオフィルム形成のための定性的または定量的なアッセイを提供する。
Abstract
バイオフィルムは、医療、産業および自然な設定で見つけることができる表面に付着した微生物のコミュニティです。実際には、バイオフィルムでの生活は、おそらくほとんどの環境での微生物の成長の支配的なモードを表します。成熟したバイオフィルムは、いくつかの異なった特徴を持っている。バイオフィルムの微生物は、通常、地域社会への構造と保護を提供する細胞外マトリックスに囲まれています。バイオフィルムで成長している微生物はまた、一般的に液体で満たされたチャンネルに囲まれたmacrocolonies（細胞の数千を含む）で構成される特徴的なアーキテクチャを持っている。バイオフィルム成長微生物はまた、臨床的に適切な抗生物質を含む抗菌薬の範囲への抵抗性は周知の事実です。
マイクロタイター皿のアッセイは、バイオフィルム形成の初期段階の研究のための重要なツールであり、このアッセイはまた、真菌バイオフィルム形成を研究するために使用されているが、細菌のバイオフィルムの研究のために主に適用されています。このアッセイは、静的、バッチ成長の条件を使用しているので、それは通常、フローセルシステムに関連付けられている成熟したバイオフィルムの形成のために許可されていません。しかし、このアッセイは、バイオフィルム形成の開始に必要な多くの因子を同定するのに有効であった（すなわち、鞭毛、繊毛、アドヘシン、サイクリック – ジ – GMPの結合や代謝に関与する酵素）と同様に細胞外多糖の生産に関与する遺伝子いる。さらに、出版された仕事は、マイクロタイター皿で増殖したバイオフィルムは、免疫系のエフェクターのような抗生物質耐性と耐性を成熟バイオフィルムのいくつかのプロパティを開発しないことを示します。
このシンプルなマイクロタイター皿のアッセイは、壁および/またはマイクロタイター皿の底部にバイオフィルムを形成することができます。アッセイのハイスループットな性質は、遺伝子スクリーニングだけでなく、様々な成長条件の下で、複数の菌株によってバイオフィルム形成のテストに役立ちます。このアッセイの亜種がこれに限定されないが、シュードモナス、 コレラ菌 、 大腸菌、staphylocci、腸球菌 、 マイコバクテリアおよび真菌を含む微生物の様々な、のために初期のバイオフィルム形成を評価するために使用されています。
プロトコルここで説明するには、我々はモデル生物、緑膿菌によるバイオフィルム形成を研究するために、このアッセイの使用に焦点を当てます。このアッセイでは、バイオフィルム形成の程度は、染料クリスタルバイオレット（CV）を用いて測定されます。しかし、他の比色及び代謝汚れの数は、マイクロタイタープレートアッセイを用いてバイオフィルム形成の定量化のために報告されている。マイクロタイタープレートアッセイの容易さ、低コストと柔軟性がバイオフィルムの研究のための重要なツールきました。
Protocol
Discussion
このメソッドは、微生物種の多様なで使用するように変更することができます。非運動性の微生物は、通常、ウェルの底に付着しながら運動性微生物は、一般的に、壁及び/または井戸の底に付着する。バイオフィルム形成（すなわち、増殖培地、温度、インキュベーションの時間）の最適条件は、それぞれの微生物に対して経験的に決定する必要があります。私はそれぞれの菌株または条件…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
シェリークチマ、ピートニューウェルと図1の画像を提供するためのロバートシャンクスに感謝します。この作品は、GAOにNIHの助成金R01AI083256によってサポートされていました
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | |||
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | ||
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | ||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | ||
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. | |
| Glucose | Fisher | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Casamino acids | Beckton-Dickinson | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Arginine | Sigma | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids | |
| Microtiter plates | Beckton-Dickinson | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. | |
| Microtiter plate lids | Beckton-Dickinson | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. | |
| Crystal violet | Sigma | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
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