Summary

Dish microtitulação Assay formação de biofilme

Published: January 30, 2011
doi:

Summary

O ensaio descreve um meio rápido de medir a formação de biofilme no início de bactérias e fungos. Este método utiliza uma placa de microtitulação, como o substrato para formação de biofilme microbiano, e do biofilme é visualizada utilizando cepa cristal violeta. O ensaio fornece tanto um ensaio qualitativo ou quantitativo para a formação de biofilme cedo.

Abstract

Biofilmes são comunidades de micróbios ligados a superfícies, que podem ser encontrados em ambientes médicos, industrial e natural. Na verdade, a vida em um biofilme, provavelmente, representa o modo predominante de crescimento para os micróbios na maioria dos ambientes. Biofilmes maduros têm algumas características distintas. Micróbios biofilme são normalmente cercados por uma matriz extracelular que fornece estrutura e proteção para a comunidade. Micróbios que crescem em um biofilme também têm uma arquitectura característica geralmente compostas por macrocolonies (contendo milhares de células), rodeadas por canais cheios de líquido. Biofilme-grown micróbios também são notórios por sua resistência a uma gama de agentes antimicrobianos, incluindo antibióticos clinicamente relevantes.

O ensaio de microtitulação prato é uma importante ferramenta para o estudo dos estágios iniciais de formação de biofilme, e tem sido aplicado principalmente para o estudo de biofilme bacteriano, embora este ensaio também tem sido usado para estudar a formação de biofilmes de fungos. Porque este ensaio utiliza estática, lote crescimento condições, não permite a formação do biofilme maduro normalmente associados com sistemas de célula de fluxo. No entanto, o ensaio tem sido eficaz na identificação de muitos fatores necessários para o início da formação de biofilme (ie, flagelos, pili, adesinas, enzimas envolvidas na cíclico-di-GMP ligação e metabolismo) e assim como genes envolvidos na produção de polissacarídeo extracelular. Além disso, trabalhos publicados indicam que os biofilmes cultivadas em placas de microtitulação se desenvolvem algumas propriedades de biofilmes maduros, como um antibiótico tolerância e resistência à efetores do sistema imune.

Este ensaio prato simples de microtitulação permite a formação de um biofilme na parede e / ou fundo de um prato de microtitulação. A natureza de alto rendimento do ensaio o torna útil para as telas de genética, bem como a formação de biofilme por cepas de testes múltiplos sob várias condições de cultivo. Variantes deste ensaio foram usadas para avaliar a formação de biofilme inicial para uma ampla variedade de micróbios, incluindo mas não limitado a, pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococos, micobactérias e fungos.

No protocolo descrito aqui, vamos nos concentrar sobre o uso deste ensaio para estudar a formação de biofilme pelo modelo aeruginosa organismo Pseudomonas. Neste ensaio, a extensão da formação de biofilme é medida usando o corante cristal violeta (CV). No entanto, uma série de outras manchas colorimétrico e metabólicas têm sido relatadas para a quantificação da formação de biofilme utilizando o ensaio de placa de microtitulação. A facilidade, baixo custo e flexibilidade do ensaio de microplaca tornou uma ferramenta fundamental para o estudo de biofilmes.

Protocol

1. O crescimento de um biofilme Crescer uma cultura da Pseudomonas aeruginosa do tipo selvagem ou cepa mutante durante a noite em um meio rico (ou seja, LB) Diluir a 1:100 cultura durante a noite em meio fresco para ensaios de biofilme. Um meio de ensaio padrão biofilme de P. aeruginosa é M63 meio mínimo suplementado com sulfato de magnésio, glicose e ácidos casamino (ver quadro). Como um biofilme, promovendo alternativas meio que estimula o crescimento menos planctônicas e b…

Discussion

Este método pode ser modificada para uso com uma grande variedade de espécies microbianas. Micróbios móveis tipicamente aderir às paredes e / ou fundo dos poços, enquanto os não-móveis micróbios normalmente aderir ao fundo dos poços. As condições ideais para a formação de biofilme (ou seja, meio de crescimento, temperatura, tempo de incubação) deve ser determinado empiricamente para cada micróbio. Eu recomendo realizar múltiplas repetições para cada estirpe ou condição (4-8), e incluindo um control…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Meus agradecimentos a Sherry Kuchma, Pete Newell e Shanks Robert para fornecer as imagens na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo NIH para conceder R01AI083256 GAO

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
1 X M63       Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4   Fisher P285-500  
K2HPO4   Fisher P288-500  
(NH4)2SO4   Sigma A5132  
Magnesium sulfate   Fisher M63-500 Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Glucose   Fisher D16-3 Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Casamino acids   Beckton-Dickinson 223050 Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Arginine   Sigma A5131 Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
Microtiter plates   Beckton-Dickinson 353911 Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Microtiter plate lids   Beckton-Dickinson 353913 The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
Crystal violet   Sigma 229641000 Prepare as a 0.1% solution in water.

References

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O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437, doi:10.3791/2437 (2011).

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