Summary

Changement de forme d'imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

Published: March 30, 2011
doi:

Summary

Le développement précoce de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est caractérisée par un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont bien adaptés pour des approches d'imagerie. Cet article décrit les outils et méthodes de base nécessaires à l'imagerie confocale direct d'embryons de drosophile, et mettra l'accent sur un changement de forme de la cellule appelée cellularisation.

Abstract

Le développement de l'embryon de Drosophila melanogaster subit un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont extrêmement sensibles à vivre l'imagerie confocale. Les changements de forme cellulaire chez la mouche sont analogues à celles dans les organismes supérieurs, et ils conduisent la morphogenèse des tissus. Ainsi, dans de nombreux cas, leur étude a des implications directes pour la compréhension de la maladie humaine (tableau 1) 1-5. Sur l'échelle sub-cellulaire, ces changements de forme des cellules sont le produit d'activités allant de l'expression génique au transduction du signal, la polarité cellulaire, le remodelage du cytosquelette et le trafic membranaire. Ainsi, l'embryon de drosophile permet non seulement le contexte pour évaluer les changements de forme cellulaire comme ils se rapportent à la morphogenèse des tissus, mais offre également un environnement complètement physiologique pour étudier les activités sub-cellulaire que les cellules forme.

Le protocole décrit ici est conçu à l'image d'un changement de cellule spécifique forme appelée cellularisation. Cellularisation est un processus de croissance de la membrane plasmique dramatique, et il convertit finalement l'embryon syncytial dans le blastoderme cellulaire. C'est, à l'interphase du cycle mitotique 14, la membrane plasmique s'invagine simultanément autour de chacun des noyaux ~ 6000 corticale ancré à générer une feuille de cellules épithéliales primaires. Contre les suggestions précédentes, cellularisation n'est pas entraîné par la myosine-2 de la contractilité 6, mais est plutôt largement alimentée par exocytose de la membrane des magasins internes 7. Ainsi, cellularisation est un excellent système pour étudier le trafic membranaire pendant les changements de forme des cellules qui nécessitent une invagination membrane plasmique ou d'expansion, comme la cytocinèse ou transversale-tubules (T-tubules) morphogenèse dans le muscle.

Notez que ce protocole est facilement appliquée à l'imagerie d'autres changements de forme cellulaire dans l'embryon de mouche, et ne nécessite que de légères adaptations telles que changer la scène de la collecte d'embryons, ou en utilisant "colle embryon" pour monter l'embryon dans une orientation spécifique (tableau 1) 8-19. Dans tous les cas, le workflow est fondamentalement le même (figure 1). Les méthodes standard pour le clonage et la transgénèse chez la drosophile sont utilisées pour préparer les stocks de mouche des étables qui expriment une protéine d'intérêt, fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variantes, et ces mouches de fournir une source renouvelable d'embryons. Alternativement, les protéines fluorescentes / sondes sont directement introduits dans des embryons volée via simples techniques de la micro-injection 9-10. Ensuite, selon l'événement de développement et de changer de forme cellulaire à imager, les embryons sont collectés et mis en scène par la morphologie d'un microscope à dissection, et enfin positionné et monté pour imagerie time-lapse sur un microscope confocal.

Protocol

1. Assemblez Coupes de collecte d'embryons Découpez le fond d'un 100 mL de Tri-maïs bécher avec un rasoir, ce qui rend le bord aussi lisse que possible. Les tasses sont faciles à manipuler si vous aussi vous taillez les trois coins hors du top, même si cela n'est pas absolument nécessaire. Couper un carré de grillage (6 cm x 6 cm). Sur une plaque pré-chauffée à chaud, à l'intérieur d'une hotte, une couche de fumée au carré de grillage sur le dessus d'un morceau …

Discussion

Le protocole décrit aux présentes permettra de vivre, l'imagerie confocale d'un certain nombre de changements de forme cellulaire dans l'embryon de mouche en développement. Stocks GFP pour l'imagerie peut être préparé par un laboratoire individuel (tableau 2), mais beaucoup de ces stocks sont également accessibles au public à partir des centres tels que la drosophile Bloomington Stock Center à l'Université d'Indiana ( http://flystocks….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions chaleureusement Eric Wieschaus, qui a fourni la base sur laquelle ce protocole a été développé. Notre travail est soutenu par un ministère Verna & Marrs McLean, de Biochimie et Biologie Moléculaire Start-up Award, Baylor College of Medicine.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Slides   Fisherbrand/Fisher Scientific 12-550-343  
Cover slips 25×25   Fisher Scientific (Corning #2865-25) 1 2-524C  
Squirt bottles (H2O)   Fisher Scientific 02-897-11  
50 ml Falcon tubes   Fisher Scientific (BD# 352070) 14-432-22  
Bulbs for small pipets, 1 mL   Fisherbrand/Fisher Scientific 03-448-21  
Scintillation vials with caps   VWR (Wheaton #986546) 66021-533  
Tri-Corn Beakers, 100 mL   Electron Microscopy Sciences 60970  
BD Falcon Petri dish 60x15mm   Fisher Scientific (BD# 351007) 08757 100B  
BD Falcon Cell strainer   Fisher Scientific (BD#352350) 08-771-2  
Yellow pipet tips   Ranin L200  
Stainless steel mesh, 304, 12×24   Small Parts CX-0150-F-01  
Glass 5¾ inch Pasteur Pipets   Fisherbrand/Fisher Scientific 13-678-20B  
P4 Filter paper   Fisherbrand/Fisher Scientific 09-803-6F  
Rubber bands   Office Max A620645  
Scotch double-sided tape, ½ inch   Office Max A8137DM-2  
Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2   Jerry’s Artarama 56460  
Dumont #5 Forceps High Precision Inox   Electron Microscopy Services 72701-DZ  
Razor blades   VWR (BD #214010) 55411-050  
Halocarbon Oil 27   Sigma-Aldrich H 8773  
Heptane   Fisher Chemical/Fisher Scientific H360-1  
BD Bacto Agar   VWR (BD# 214010) 90000-760  
Sucrose   Sigma-Aldrich S7903  
p-Hydroxybenzoic acid   Sigma-Aldrich H5501  
Red Star Active Dry Yeast   LeSaffre 15700  
Paper towels, C-fold   Kleenex    
Heavy duty aluminum foil   Reynolds Wrap    
Bleach   Austin’s A-1 Commercial    
100% Apple juice   Ocean Spray or Tree Top    

References

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Cite This Article
Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503, doi:10.3791/2503 (2011).

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