Changement de forme d'imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons
Summary
Le développement précoce de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est caractérisée par un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont bien adaptés pour des approches d'imagerie. Cet article décrit les outils et méthodes de base nécessaires à l'imagerie confocale direct d'embryons de drosophile, et mettra l'accent sur un changement de forme de la cellule appelée cellularisation.
Abstract
Le développement de l'embryon de Drosophila melanogaster subit un certain nombre de changements de forme cellulaire qui sont extrêmement sensibles à vivre l'imagerie confocale. Les changements de forme cellulaire chez la mouche sont analogues à celles dans les organismes supérieurs, et ils conduisent la morphogenèse des tissus. Ainsi, dans de nombreux cas, leur étude a des implications directes pour la compréhension de la maladie humaine (tableau 1) 1-5. Sur l'échelle sub-cellulaire, ces changements de forme des cellules sont le produit d'activités allant de l'expression génique au transduction du signal, la polarité cellulaire, le remodelage du cytosquelette et le trafic membranaire. Ainsi, l'embryon de drosophile permet non seulement le contexte pour évaluer les changements de forme cellulaire comme ils se rapportent à la morphogenèse des tissus, mais offre également un environnement complètement physiologique pour étudier les activités sub-cellulaire que les cellules forme.
Le protocole décrit ici est conçu à l'image d'un changement de cellule spécifique forme appelée cellularisation. Cellularisation est un processus de croissance de la membrane plasmique dramatique, et il convertit finalement l'embryon syncytial dans le blastoderme cellulaire. C'est, à l'interphase du cycle mitotique 14, la membrane plasmique s'invagine simultanément autour de chacun des noyaux ~ 6000 corticale ancré à générer une feuille de cellules épithéliales primaires. Contre les suggestions précédentes, cellularisation n'est pas entraîné par la myosine-2 de la contractilité 6, mais est plutôt largement alimentée par exocytose de la membrane des magasins internes 7. Ainsi, cellularisation est un excellent système pour étudier le trafic membranaire pendant les changements de forme des cellules qui nécessitent une invagination membrane plasmique ou d'expansion, comme la cytocinèse ou transversale-tubules (T-tubules) morphogenèse dans le muscle.
Notez que ce protocole est facilement appliquée à l'imagerie d'autres changements de forme cellulaire dans l'embryon de mouche, et ne nécessite que de légères adaptations telles que changer la scène de la collecte d'embryons, ou en utilisant "colle embryon" pour monter l'embryon dans une orientation spécifique (tableau 1) 8-19. Dans tous les cas, le workflow est fondamentalement le même (figure 1). Les méthodes standard pour le clonage et la transgénèse chez la drosophile sont utilisées pour préparer les stocks de mouche des étables qui expriment une protéine d'intérêt, fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) ou ses variantes, et ces mouches de fournir une source renouvelable d'embryons. Alternativement, les protéines fluorescentes / sondes sont directement introduits dans des embryons volée via simples techniques de la micro-injection 9-10. Ensuite, selon l'événement de développement et de changer de forme cellulaire à imager, les embryons sont collectés et mis en scène par la morphologie d'un microscope à dissection, et enfin positionné et monté pour imagerie time-lapse sur un microscope confocal.
Protocol
Discussion
Le protocole décrit aux présentes permettra de vivre, l'imagerie confocale d'un certain nombre de changements de forme cellulaire dans l'embryon de mouche en développement. Stocks GFP pour l'imagerie peut être préparé par un laboratoire individuel (tableau 2), mais beaucoup de ces stocks sont également accessibles au public à partir des centres tels que la drosophile Bloomington Stock Center à l'Université d'Indiana ( http://flystocks….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions chaleureusement Eric Wieschaus, qui a fourni la base sur laquelle ce protocole a été développé. Notre travail est soutenu par un ministère Verna & Marrs McLean, de Biochimie et Biologie Moléculaire Start-up Award, Baylor College of Medicine.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Slides | Fisherbrand/Fisher Scientific | 12-550-343 | ||
| Cover slips 25×25 | Fisher Scientific (Corning #2865-25) | 1 2-524C | ||
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | ||
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific (BD# 352070) | 14-432-22 | ||
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisherbrand/Fisher Scientific | 03-448-21 | ||
| Scintillation vials with caps | VWR (Wheaton #986546) | 66021-533 | ||
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | ||
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific (BD# 351007) | 08757 100B | ||
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific (BD#352350) | 08-771-2 | ||
| Yellow pipet tips | Ranin | L200 | ||
| Stainless steel mesh, 304, 12×24 | Small Parts | CX-0150-F-01 | ||
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisherbrand/Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| P4 Filter paper | Fisherbrand/Fisher Scientific | 09-803-6F | ||
| Rubber bands | Office Max | A620645 | ||
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | ||
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | ||
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Services | 72701-DZ | ||
| Razor blades | VWR (BD #214010) | 55411-050 | ||
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | ||
| Heptane | Fisher Chemical/Fisher Scientific | H360-1 | ||
| BD Bacto Agar | VWR (BD# 214010) | 90000-760 | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | ||
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | ||
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | ||
| Paper towels, C-fold | Kleenex | |||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | |||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | |||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
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