リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚
Summary
ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ、開発の初期段階はよくイメージングアプローチに適している細胞の形状の変更の数によって特徴付けられる。この記事では、ショウジョウバエの胚のライブ共焦点イメージングに必要な基本的なツールと方法を説明します、そして細胞化と呼ばれる細胞の形状変化に焦点を当てます。
Abstract
開発キイロショウジョウバエの胚では、共焦点イメージングを生きるために非常に従順な細胞形状の変化の回数を受ける。ハエの細胞の形状の変化は、高等生物と似ています、そして、彼らは組織の形態形成を駆動する。そう、多くの場合、彼らの研究は、ヒトの疾患（表1）1-5を理解するための直接的な意味を持っています。サブセルラー規模で、これらの細胞形状の変化は、遺伝子発現からシグナル伝達、細胞極性、細胞骨格の再構成と膜輸送に至るまでの活動の産物です。このように、 ショウジョウバエの胚は、彼らが組織の形態形成に関連する細胞の形状の変化を評価するだけでなく、文脈を提供するだけでなく、形状の細胞がそのサブ細胞の活動を研究するために完全に生理学的な環境を提供しています。
プロトコルは、画像細胞化と呼ばれる特定の細胞の形状変化をするように設計されてここで説明する。細胞化は、劇的な細胞膜の成長の過程であり、そしてそれは最終的に細胞性胞胚にシンシチウム胚を変換します。有糸分裂サイクル14の相間で、すなわち、原形質膜は、同時に一次上皮細胞のシートを生成するために〜6000皮質固定された核のそれぞれの周囲に陥入する。前の提案にカウンター、細胞化は、ミオシン- 2収縮6によって駆動されていませんが、代わりに主に内部貯蔵7から膜のエキソサイトーシスによって支えられています。従って、細胞化は、細胞質分裂や筋肉の横-細管（T管）形態形成などの原形質膜の陥入や拡張を必要とする細胞の形状の変化、中膜輸送を研究するための優れたシステムです。
このプロトコルは簡単にハエの胚で他の細胞の形状変化のイメージングに適用される、そして唯一のそのような胚のコレクションのステージを変更する、または特定の方向（表で胚をマウントする"胚の接着剤"を使用するなど、わずかな適応を必要としていることに注意してください1）8-19。すべてのケースでは、ワークフローは基本的には（図1）と同じです。クローニングおよびショウジョウバエ遺伝子導入のための標準的な方法は、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはその変異体に融合された、興味のあるタンパク質を発現するサシバエの在庫を準備するために使用され、これらのハエでは胚の再生可能エネルギー源を提供しています。また、蛍光蛋白質/プローブを直接簡単なマイクロインジェクション技術90から10を経由してハエの胚に導入されています。その後、発生事象および撮像される細胞の形状変化に応じて、胚を回収して解剖顕微鏡で形態によって上演され、最後に位置し、共焦点顕微鏡でタイムラプスイメージングのためにマウント。
Protocol
Discussion
ここに記述されているプロトコルは、開発途上ハエの胚の細胞の形状の変化の数のライブ、共焦点イメージングを可能にするでしょう。イメージングのためのGFPの株式は、個々の研究室（表2）により調製するが、多くのそのような株は、インディアナ大学（アットブルーミントンショウジョウバエストックセンターとしてのセンターからも公開されていることができる<a href="http://flyst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は感謝して、このプロトコルが開発された基盤を提供するエリックヴィーシャウを、認めます。私たちの仕事は、ヴァーナ＆マーズマクリーン生化学部および分子生物学スタートアップ賞、ベイラー医科大学でサポートされています。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Slides | Fisherbrand/Fisher Scientific | 12-550-343 | ||
| Cover slips 25×25 | Fisher Scientific (Corning #2865-25) | 1 2-524C | ||
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | ||
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific (BD# 352070) | 14-432-22 | ||
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisherbrand/Fisher Scientific | 03-448-21 | ||
| Scintillation vials with caps | VWR (Wheaton #986546) | 66021-533 | ||
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | ||
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific (BD# 351007) | 08757 100B | ||
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific (BD#352350) | 08-771-2 | ||
| Yellow pipet tips | Ranin | L200 | ||
| Stainless steel mesh, 304, 12×24 | Small Parts | CX-0150-F-01 | ||
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisherbrand/Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| P4 Filter paper | Fisherbrand/Fisher Scientific | 09-803-6F | ||
| Rubber bands | Office Max | A620645 | ||
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | ||
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | ||
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Services | 72701-DZ | ||
| Razor blades | VWR (BD #214010) | 55411-050 | ||
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | ||
| Heptane | Fisher Chemical/Fisher Scientific | H360-1 | ||
| BD Bacto Agar | VWR (BD# 214010) | 90000-760 | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | ||
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | ||
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | ||
| Paper towels, C-fold | Kleenex | |||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | |||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | |||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
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