Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni
Summary
Prime fasi dello sviluppo del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è caratterizzato da una serie di modifiche la forma delle cellule che sono adatti per gli approcci di imaging. Questo articolo descrive gli strumenti di base e metodi necessari per vivere l'imaging confocale di embrioni di Drosophila, e si concentrerà su un cambiamento di forma delle cellule chiamato cellularization.
Abstract
Lo sviluppo dell'embrione Drosophila melanogaster subisce una serie di modifiche la forma delle cellule che sono altamente suscettibili di vivere l'imaging confocale. Alterazioni cellulari forma nel volo sono analoghi a quelli di organismi superiori, e guidano la morfogenesi dei tessuti. Così, in molti casi, il loro studio ha implicazioni dirette per la comprensione delle malattie umane (Tabella 1) 1-5. Sulla scala sub-cellulare, queste alterazioni cellulari forma sono il prodotto di attività che vanno dalla espressione genica di trasduzione del segnale, polarità cellulare, rimodellamento del citoscheletro e il traffico di membrana. Quindi, l'embrione di Drosophila fornisce non solo il contesto per valutare le variazioni forma delle cellule in cui riguardano la morfogenesi dei tessuti, ma offre anche un ambiente del tutto fisiologico per studiare le sub-cellulare attività che le cellule forma.
Il protocollo qui descritto è stato progettato per una specifica immagine di cambiare la forma delle cellule chiamato cellularization. Cellularization è un processo di crescita drammatica della membrana plasmatica, e lo converte in ultima analisi, l'embrione sinciziale nel Blastoderm cellulare. Cioè, in interfase del ciclo mitotico 14, la membrana plasmatica invaginates simultaneamente intorno a ciascuno dei nuclei ~ 6000 corticale ancorato a generare un foglio di primaria cellule epiteliali. Contro suggerimenti precedenti, cellularization non è guidato da miosina-2 contrattilità 6, ma è invece alimentato in gran parte da esocitosi della membrana dai depositi interni 7. Così, cellularization è un sistema eccellente per studiare il traffico di membrana durante i cambi di forma delle cellule che richiedono invaginazione della membrana plasmatica o di espansione, come citocinesi o trasversali-tubulo (T-tubuli) morfogenesi nel muscolo.
Si noti che questo protocollo può essere facilmente applicato al di imaging di altri cambiamenti forma delle cellule nell'embrione volare, e richiede solo piccole modifiche come cambiare la fase di raccolta degli embrioni, o usando "colla embrione" per montare l'embrione con un orientamento specifico (Tabella 1) 8-19. In tutti i casi, il flusso di lavoro è fondamentalmente la stessa (Figura 1). Metodi standard per la clonazione e la Drosophila transgenesi vengono utilizzati per preparare le scorte volare stabili che esprimono una proteina di interesse, unito alla proteina fluorescente verde (GFP) o sue varianti, e queste mosche fornire una fonte rinnovabile di embrioni. In alternativa, proteine fluorescenti / sonde vengono inserite direttamente in embrioni di volare attraverso semplici micro-iniezione tecniche 9-10. Poi, a seconda dell'evento di sviluppo e cambiano forma delle cellule per essere ripreso, gli embrioni sono raccolti e messo in scena da morfologia su un microscopio da dissezione, e finalmente posizionato e montato per time-lapse imaging su un microscopio confocale.
Protocol
Discussion
Il protocollo qui descritto consentirà di vivere, l'imaging confocale di una serie di cambiamenti nella forma delle cellule dell'embrione volano di sviluppo. Scorte GFP per l'imaging può essere preparato da un laboratorio individuale (Tabella 2), ma molte di tali scorte sono accessibili anche al pubblico da centri come Bloomington Drosophila archivi Center presso l'Università dell'Indiana ( http://flystocks.bio.indiana.edu ) e flytrap magazzi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo con gratitudine Eric Wieschaus, che ha fornito il fondamento su cui è stato sviluppato questo protocollo. Il nostro lavoro è supportato da una McLean Verna & Marrs Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare Start-up Award, Baylor College of Medicine.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Slides | Fisherbrand/Fisher Scientific | 12-550-343 | ||
| Cover slips 25×25 | Fisher Scientific (Corning #2865-25) | 1 2-524C | ||
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | ||
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific (BD# 352070) | 14-432-22 | ||
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisherbrand/Fisher Scientific | 03-448-21 | ||
| Scintillation vials with caps | VWR (Wheaton #986546) | 66021-533 | ||
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | ||
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific (BD# 351007) | 08757 100B | ||
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific (BD#352350) | 08-771-2 | ||
| Yellow pipet tips | Ranin | L200 | ||
| Stainless steel mesh, 304, 12×24 | Small Parts | CX-0150-F-01 | ||
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisherbrand/Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| P4 Filter paper | Fisherbrand/Fisher Scientific | 09-803-6F | ||
| Rubber bands | Office Max | A620645 | ||
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | ||
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | ||
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Services | 72701-DZ | ||
| Razor blades | VWR (BD #214010) | 55411-050 | ||
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | ||
| Heptane | Fisher Chemical/Fisher Scientific | H360-1 | ||
| BD Bacto Agar | VWR (BD# 214010) | 90000-760 | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | ||
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | ||
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | ||
| Paper towels, C-fold | Kleenex | |||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | |||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | |||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
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