Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos
Summary
Frühe Entwicklung der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wird durch eine Reihe von Zell-Form verändert, dass auch für die Bildgebung Ansätze geeignet sind, geprägt. Dieser Artikel beschreibt grundlegende Werkzeuge und Methoden für die Live-konfokale Abbildung von Drosophila Embryonen erforderlich ist, und wird auf eine Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung konzentrieren.
Abstract
Die Entwicklung von Drosophila melanogaster Embryo durchläuft eine Reihe von Zellform Veränderungen, die sehr gut für konfokale Bildgebung leben. Zellform Veränderungen in-the-fly sind analog zu denen in höheren Organismen, und sie fahren Gewebemorphogenese. Also, in vielen Fällen hat ihre Studie direkte Implikationen für das Verständnis menschlicher Erkrankungen (Tabelle 1) 1-5. Auf der sub-zellulärer Ebene sind diese Zellform Veränderungen das Produkt der Aktivitäten reicht von der Genexpression bis Signaltransduktion, Zellpolarität, Zytoskelett-Umbau-und Membran-Handel. Somit stellt die Drosophila-Embryo nicht nur den Kontext zu Zellform Veränderungen zu bewerten, da sie Gewebemorphogenese beziehen, sondern bietet auch eine völlig physiologischen Umgebung, die sub-zellulären Aktivitäten, die Form-Zellen zu studieren.
Die hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Bild einer bestimmten Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung. Zellularisierung ist ein Prozess der dramatischen Plasmamembran Wachstum, und es letztendlich wandelt die Syncytial Embryo in die zelluläre Blastoderm. Das heißt, bei der Interphase der Mitose-Zyklus 14, der Plasmamembran gleichzeitig stülpt sich um jede ~ 6000 kortikal verankert Kerne auf ein Blatt von primären Epithelzellen zu generieren. Zähler zur vorherigen Vorschläge, ist Zellularisierung nicht von Myosin-2 Kontraktilität 6 angetrieben, sondern wird weitgehend durch Exozytose von Membran aus internen Shops 7 angeheizt. So ist Zellularisierung ein hervorragendes System zur Untersuchung von Membran-Handel während der Zellform Veränderungen, die Plasmamembran Invagination oder Erweiterung erfordern, wie Zytokinese oder Quer-Tubuli (T-Tubulus) Morphogenese in der Muskulatur.
Beachten Sie, dass dieses Protokoll einfach auf die Abbildung von anderen Zellform Veränderungen in-the-fly Embryo angelegt und erfordert nur geringe Anpassungen wie die Änderung der Phase der Embryo-Entnahme oder Verwendung von "Embryo Kleber", um den Embryo in einer bestimmten Orientierung (Tabelle montieren 1) 8-19. In allen Fällen wird der Workflow im Grunde die gleichen (Abbildung 1). Standard-Verfahren für das Klonen und Drosophila Transgenese werden verwendet, um stabile fliegen Aktien, die ein Protein von Interesse exprimieren, fusioniert mit Green Fluorescent Protein (GFP) oder dessen Varianten vorzubereiten und diese Fliegen bieten eine erneuerbare Quelle von Embryonen. Alternativ sind auch fluoreszierende Proteine / Sonden direkt in fly Embryonen über einfache Mikro-Injektion Techniken 9-10 eingeführt. Dann, je nach Entwicklungs-Event-und Zell-Form zu ändern, die abgebildet werden, sind Embryonen gesammelt und inszeniert von Morphologie auf einem Binokular und schließlich positioniert und montiert für Zeitraffer-Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop.
Protocol
Discussion
Das Protokoll beschriebenen wird die Live-, konfokale Bildgebung von einer Reihe von Zellform Veränderungen in den Entwicklungsländern zu fliegen Embryo zu ermöglichen. GFP Aktien für die Bildgebung kann durch einen individuellen Labor (Tabelle 2) hergestellt werden, aber viele dieser Bestände sind auch öffentlich verfügbar von Zentren wie Bloomington Drosophila Stock Center an der Indiana University ( http://flystocks.bio.indiana.edu ) und Fliegenfalle Stoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Eric Wieschaus, der das Fundament, auf dem dieses Protokoll wurde entwickelt, zur Verfügung gestellt. Unsere Arbeit wird durch eine Verna & Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology Start-up Award, Baylor College of Medicine unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Slides | Fisherbrand/Fisher Scientific | 12-550-343 | ||
| Cover slips 25×25 | Fisher Scientific (Corning #2865-25) | 1 2-524C | ||
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | ||
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific (BD# 352070) | 14-432-22 | ||
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisherbrand/Fisher Scientific | 03-448-21 | ||
| Scintillation vials with caps | VWR (Wheaton #986546) | 66021-533 | ||
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | ||
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific (BD# 351007) | 08757 100B | ||
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific (BD#352350) | 08-771-2 | ||
| Yellow pipet tips | Ranin | L200 | ||
| Stainless steel mesh, 304, 12×24 | Small Parts | CX-0150-F-01 | ||
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisherbrand/Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| P4 Filter paper | Fisherbrand/Fisher Scientific | 09-803-6F | ||
| Rubber bands | Office Max | A620645 | ||
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | ||
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | ||
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Services | 72701-DZ | ||
| Razor blades | VWR (BD #214010) | 55411-050 | ||
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | ||
| Heptane | Fisher Chemical/Fisher Scientific | H360-1 | ||
| BD Bacto Agar | VWR (BD# 214010) | 90000-760 | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | ||
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | ||
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | ||
| Paper towels, C-fold | Kleenex | |||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | |||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | |||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
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