Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon
Summary
Tidiga utvecklingen av bananflugan, Drosophila melanogaster, kännetecknas av ett antal förändringar cell form som är väl lämpade för avbildning metoder. Denna artikel kommer att beskriva grundläggande verktyg och metoder som krävs för att leva konfokal avbildning av Drosophila embryon, och kommer att fokusera på en cell form förändring kallas cellularization.
Abstract
Utvecklingsländerna Drosophila melanogaster embryo genomgår en rad förändringar cell form som är mycket mottaglig att leva konfokala bildhantering. Cell formförändringar i gylfen motsvarar dem i högre organismer, och de kör vävnad morfogenes. Så, i många fall har deras studie direkta konsekvenser för förståelsen av mänsklig sjukdom (tabell 1) 1-5. På den sub-cellulära skala, dessa celler formförändringar är en produkt av aktiviteter, från genuttryck till signaltransduktion, cell polaritet, cytoskelettala ombyggnader och membran människohandel. Således ger Drosophila embryot inte bara sammanhanget att utvärdera cellförändringar form som de avser vävnad morfogenes, men erbjuder också en helt fysiologisk miljö att studera sub-cellulära aktiviteter som formar celler.
Protokollet som beskrivs här är avsedd att bilden en specifik förändring cell formen kallas cellularization. Cellularization är en process av dramatiska plasmamembran tillväxt, och det i slutändan omvandlar syncytial embryot till den cellulära BLASTODERM. Det är, vid interfas av mitotiska cykel 14, invaginates plasmamembranet samtidigt runt varje för ~ 6000 cortically förankrade kärnor för att skapa ett ark med primär epitelceller. Mot tidigare förslag är cellularization inte drivs av myosin-2 kontraktilitet 6, utan istället drivs till stor del genom exocytos av membran från interna affärer 7. Således är cellularization ett utmärkt system för att studera membran handel under cellförändringar form som kräver invagination plasmamembran eller expansion, som cytokines eller transversell-tubuli (T-tubuli) morfogenes i muskeln.
Observera att detta protokoll lätt appliceras på avbildning av andra cellförändringar form i flugan embryot, och kräver endast smärre anpassningar till exempel ändra stadiet av embryosamlings, eller med hjälp av "embryo lim" för att montera embryo i en viss riktning (Tabell 1) 8-19. I alla fall är arbetsflödet i stort sett samma (Figur 1). Standardmetoder för kloning och Drosophila genmodifiering används för att förbereda en stabil flyga lager som uttrycker ett protein av intresse, smält till grönt fluorescerande protein (GFP) eller dess varianter, och dessa flugor ge en förnybar embryon. Alternativt är fluorescerande proteiner / prober direkt förs in flyga embryon via enkla mikroinjektion tekniker 9-10. Sedan, beroende på utvecklings-händelsen och cell formen förändringar som ska avbildas, är embryon samlas in och iscensatt av morfologi på dissekera mikroskop, och slutligen placeras och monteras för Time-lapse avbildning på ett konfokalmikroskop.
Protocol
Discussion
Protokollet som beskrivs här kommer att tillåta leva, konfokala avbildning av ett antal förändringar cell form i utvecklingsländerna flyga embryot. GFP lager för avbildning kan förberedas i ett enskilt laboratorium (tabell 2), men många av dessa lager finns också tillgängliga för allmänheten från centra som Bloomington Drosophila Lager Center vid Indiana University ( http://flystocks.bio.indiana.edu ) och Flytrap Lager Center vid Yale University ( <a h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner tacksamt Eric Wieschaus, som gav grunden för detta protokoll utvecklades. Vårt arbete stöds av en Verna & Marrs McLean Institutionen för biokemi och molekylärbiologi Start-up Award, Baylor College of Medicine.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Slides | Fisherbrand/Fisher Scientific | 12-550-343 | ||
| Cover slips 25×25 | Fisher Scientific (Corning #2865-25) | 1 2-524C | ||
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | ||
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific (BD# 352070) | 14-432-22 | ||
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisherbrand/Fisher Scientific | 03-448-21 | ||
| Scintillation vials with caps | VWR (Wheaton #986546) | 66021-533 | ||
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | ||
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific (BD# 351007) | 08757 100B | ||
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific (BD#352350) | 08-771-2 | ||
| Yellow pipet tips | Ranin | L200 | ||
| Stainless steel mesh, 304, 12×24 | Small Parts | CX-0150-F-01 | ||
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisherbrand/Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| P4 Filter paper | Fisherbrand/Fisher Scientific | 09-803-6F | ||
| Rubber bands | Office Max | A620645 | ||
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | ||
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | ||
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Services | 72701-DZ | ||
| Razor blades | VWR (BD #214010) | 55411-050 | ||
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | ||
| Heptane | Fisher Chemical/Fisher Scientific | H360-1 | ||
| BD Bacto Agar | VWR (BD# 214010) | 90000-760 | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | ||
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | ||
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | ||
| Paper towels, C-fold | Kleenex | |||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | |||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | |||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. Toward understanding the genetic basis of neural tube defects. Clin Genet. 71, 295-310 (2007).
- Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein. Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131, 3021-3034 (2004).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).
- Lecuit, T., Wieschaus, E. Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo. J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo. Dev Cell. 16, 93-104 (2009).
- Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation. Curr Biol. , (2010).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. u. f. a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization. Dev Cell. 14, 775-786 (2008).
- Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134, 567-578 (2007).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457, 495-499 (2009).
- Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 429, 667-671 (2004).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Dev Cell. 11, 459-470 (2006).
- Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation. Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr Biol. 20, 359-366 (2010).
- Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. a. r. t. i. n. e. z., A, . Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila. Development. 136, 1889-1898 (2009).
- Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure. Cell. 137, 1331-1342 (2009).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization. J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
