Summary
Кальций является вездесущий посланник в нервной системы, необходимой для запуска выпуска нейротрансмиттера и изменения в синаптической силы. Здесь мы показываем, технику для погрузки Са 2 +-индикаторы в терминалах дрозофилы нерва. Мы также демонстрируют изготовление необходимых приборов и подчеркнуть точки решающее значение для успеха этой техники.
Abstract
Кальций играет много ролей в нервной системе, но ни один более впечатляющим, чем в качестве триггера для выпуска нейротрансмиттера, и никто более глубоким, чем в качестве посланника необходимо для синаптической пластичности, поддерживающего обучения и памяти. Для дальнейшего выяснения молекулярной основы Са 2 +-зависимые синаптических механизмов, модели требуется система, которая является и генетически ковкого и физиологически доступной. Дрозофилы предоставляет такую модель. В этой системе, генетически закодированы люминесцентные индикаторы доступны для выявления Са 2 + изменения в нервных окончаниях. Тем не менее, эти показатели имеют ограниченные чувствительность к Са 2 + и часто показывают нелинейную реакцию. Синтетические люминесцентные индикаторы лучше подходят для измерения быстрых Са 2 + изменения, связанные с нервной активностью. Здесь мы показываем, технику для погрузки декстран-сопряженных синтетического Ca 2 + показатели в живых нервных окончаний у личинок дрозофилы. Особый акцент делается на тех аспектах протокол наиболее решающее значение для успеха этой техники, например, как избежать статических разрядов электричества вдоль изолированных нервов, поддержании здоровья подготовки в течение длительных периодов погрузки, а также обеспечение аксон выживание, предоставляя Са 2 + содействовать уплотнения разорвала окончаниях аксона. Низкое сродство декстран-сопряженных Са 2 +-индикаторы, такие как флуоресцентные-4 и rhod, доступны, которые показывают высокое отношение сигнал-шум в то время как минимально нарушая пресинаптических Са 2 + динамики. Декстран сопряжения помогает предотвратить Са 2 + показатели, поглощенных в органеллах типа митохондрий. Погрузка техника может быть применена в равной степени к личинки, эмбрионы и взрослых.
Protocol
- Выберите чистой блюдо рассечение, которое не подвергается какой-либо фиксаторов.
- Рассеките блуждающих 3-го возраста личинки дрозофилы Drosophila в Средние Шнайдера содержащие Са 2 + и L-глутамин, (не отрезайте любой нервы или волокон повреждения мышц № 7, 6, 13 или 12).
- Выберите стеклянный заполнения пипетки с 12 микрон наконечник (внутренний диаметр).
- Использование шприцев и трубки (для применения отрицательного давления на пипетку) обеспечить, чтобы кончик пипетки ничто не мешает.
- Выберите тонкой пластиковой заполнения нити, которые могут быть вставлены по всей длине стеклянной пипетки.
- Нарисуйте ~ 1 см 5 мМ декстран-сопряженных Са 2 +-индикатор в пластиковой нити.
- Вырезаны все сегменте нервы.
- Поддержка пипетки на рампе, которая позволит пипетки подойти к вентральной средней линии расчлененный личинки.
- Нарисуйте обрезанный конец нерва сегменте № 4, не щипать нервы, в конце пипетки (включая небольшое количество средних Шнайдера).
- Снимите трубку и вставить пластиковую нить в пипетку до конца нити в пределах 50 микрон разреза конца нерва (не дотрагиваясь до нерва).
- Извлечь достаточной Са 2 +-индикатор на нервные окончания увеличить объем среды Шнайдера примерно на 33% (конечная концентрация должна быть <2 мм). Важно - Это должно быть завершено в течение 5 минут после резки нерва.
- Место препарата в темноте при комнатной температуре в то время как нервные нагрузки.
- Через 40 минут удалите Са 2 +-индикатора с помощью нити.
- Оставьте пипетки на место и заполнить его полностью со средним свежие Шнайдера, так как это будет использоваться для применения стимулирующих импульсов нерва.
- Разрешить Са 2 +-индикатор, чтобы уравновесить в нерв, по крайней мере 60 минут, но не более чем на 4 часа, до начала Са 2 +-изображений.
- Промыть подготовки со средним свежие Шнайдера каждые 30 минут во время его уравновешивания.
- За 20 минут до визуализации заменить средний Шнайдера с гемолимфы-Like № 6 решения (HL6; Маклеод и др., 2002;. 2003).
- L-глутаминовой кислоты или глутамата может быть добавлен к HL6 решение на 7 мм, чтобы уменьшить чувствительность постсинаптических рецепторов глутамата, чтобы предотвратить нервные вызвало сокращение мышц (Маклеод и др., 2004;. Реифф и др., 2002;. 2005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
