Summary
En este informe se describe un método para el aislamiento y la cultura de los nichos de células progenitoras de los riñones de embriones de ratón que pueden utilizarse para estudiar las vías de señalización que regulan células madre / progenitoras de los riñones en desarrollo. Estas células cultivadas son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, que permite la manipulación eficiente de las vías de candidato.
Abstract
El desarrollo embrionario del riñón ha sido ampliamente estudiado como un modelo para la interacción epitelio-mesénquima en la organogénesis y para ganar la comprensión de los orígenes de la enfermedad renal congénita. Más recientemente, la posibilidad de dirigir ingenuo células madre embrionarias hacia destinos nefrogénica ha sido explorada en el campo emergente de la medicina regenerativa. Los estudios genéticos en ratones han identificado varios caminos necesarios para el desarrollo del riñón, y un catálogo global de la transcripción de genes en el órgano ha sido recientemente generada http://www.gudmap.org/ , proporcionando numerosas candidato reguladores de las funciones esenciales del desarrollo. Organogénesis del riñón de roedores puede ser estudiado en cultivos de órganos, y muchos informes se ha utilizado este enfoque para analizar los resultados de la aplicación de cualquiera de las proteínas candidatas o derribar la expresión de genes candidatos mediante siRNA o morfolinos. Sin embargo, la aplicabilidad de la cultura de órganos para el estudio de la señalización que regula la madre / la diferenciación de células progenitoras en comparación con la renovación en el riñón en desarrollo es limitado, como órganos cultivados contienen una difusión compacta de la matriz extracelular limitación de las macromoléculas y las partículas de virus. Para el estudio de la señalización celular eventos que influyen en la madre / nicho de células progenitoras en el riñón, hemos desarrollado un sistema de célula primaria que establece la zona nefrogénica o nicho de células progenitoras de la ex vivo de riñón en desarrollo en el aislamiento del inductor de la diferenciación del epitelio. Utilizando digestión enzimática limitada, las células de la zona nefrogénica puede ser liberado de forma selectiva el desarrollo de los riñones en E17.5. Después de la filtración, estas células pueden ser cultivadas en una monocapa irregular con las condiciones más favorables. Análisis de marcadores de genes demuestra que estos cultivos contienen una distribución de los tipos celulares característicos de la zona nefrogénica en vivo, y que mantienen la expresión adecuada del gen marcador durante el período de cultivo. Estas células son muy accesibles a pequeñas moléculas y tratamiento de proteínas recombinantes, y esto es importante también para la transducción viral, lo que facilita enormemente el estudio de los candidatos madre / progenitoras efectos sobre las células del regulador. Parámetros básicos de biología celular como la proliferación y muerte celular, así como cambios en la expresión de marcadores moleculares característicos de la nefrona células madre / progenitoras in vivo puede ser utilizado con éxito como los resultados experimentales. Trabajo en curso en nuestro laboratorio con esta nueva técnica de células primarias tiene como objetivo descubrir los mecanismos básicos que rigen la regulación de la auto-renovación versus diferenciación en nefrona células madre / progenitoras.
Protocol
1. Preparación de los reactivos para la digestión del Riñón
- 1,5 ml de 0,25% de colagenasa A (w / v) y una solución de pancreatina digerir% (w / v) serán necesarios para la extracción de células de la zona nefrogénica (NZCs) de 8 E17.5 riñones. Debido a la pancreatina de aproximadamente 2 horas para disolver a temperatura ambiente, lo suficiente para digerir la solución al mayor número de riñones embrionarios espera que debe hacer antes del experimento. Prepare una solución digerir primero la adición de 25 mg de colagenasa A 10 ml de fosfato de Dulbecco solución salina tamponada (DPBS) en un claro de 15 ml, tubo de centrífuga estéril. Es muy importante que el DPBS no contiene calcio o magnesio, ya que esto interfiere con la digestión enzimática. Mezcle la solución en un nutator durante 10 minutos para disolver colagenasa A. Añadir 100 mg de pancreatina de colagenasa disuelto una solución y se mezcla en un nutator por lo menos 2 horas. Por otra parte, la colagenasa A / pancreatina solución de digestión se pueden mezclar en una nutator la noche a 4 ° C. Se recomienda que use una máscara, como la colagenasa A y pancreatina se dispersan fácilmente en la atmósfera durante el pesaje y puede irritar los conductos nasales.
- Preparar un 5% de suero fetal bovino (SFB) (v / v) en solución salina tamponada de Hank (HBSS). Invierta para mezclar. 1 ml por cada tubo, de 8 de los riñones será necesario.
- Preparar medio de cultivo de queratinocitos, completándolo medio libre de suero con 1% de glutamina (v / v) y el 1% penicilina-estreptomicina (Penstrep) (v / v).
- Capa estéril de poliestireno de fondo plano placas de cultivo de tejidos (96, 48, 24 o 6 también) con la solución de fibronectina humana a una concentración de 5 mg por cm2 de superficie de crecimiento. 5 mg de polvo de fibronectina se resuspende en 5 ml de H 2 O. estéril Este se diluye 1:25 en DPBS estéril sin calcio ni magnesio y 250 ml se añade a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Las placas se incuban con la solución de fibronectina a temperatura ambiente durante 1 hora seguido de 1 hora a 4 ° C. Por otra parte, las placas pueden ser incubadas durante la noche a 4 ° C. La solución se aspira en una campana de flujo laminar antes de la adición de medio / las células.
2. Los riñones de disección y eliminación de cápsulas (Hecho a temperatura ambiente)
- En E17.5, el sacrificio de la madre con un procedimiento aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo, extirpar el útero, y colocarlo en una placa de Petri que contiene DPBS con calcio y magnesio. Bajo un microscopio de disección, el uso de fórceps de relojería para eliminar cada embrión en el útero y decapitar a cada embrión. Una vez que toda la camada y está fuera del útero, la transferencia de los embriones a una placa de Petri que contiene limpia DPBS suficiente con el calcio y el magnesio para cubrir completamente los embriones dejando tras de sí tanta sangre y restos de tejido como sea posible.
- Con unas pinzas, hacer una incisión circunferencial en la pared abdominal del embrión a nivel del ombligo. A continuación, coloque el embrión en su espalda, el pasador hacia abajo en los hombros con un juego de pinzas, y quitar los órganos internos de los pulmones hasta la vejiga con el otro juego de pinzas. Con la práctica esto se puede hacer en un solo movimiento. Los riñones deben adjuntarse a la parte posterior de la masa de los órganos. Si los riñones no permanecen unidos a los órganos eviscerados, pueden ser cuidadosamente removida de la pared dorsal del cuerpo. Los riñones que han sido dañados durante el proceso de disección debe ser desechada, ya que va a contaminar el cultivo final con los tipos de células inapropiadas.
- Suavemente se burlan de distancia de los riñones del resto de los órganos, teniendo cuidado de mantener los riñones conectados entre sí. Mantener el tejido entre los riñones con un juego de pinzas de agarre y de la glándula suprarrenal adjunta a uno de los riñones con las pinzas de otros. La glándula adrenal debe ser unido a la cápsula renal. Con cuidado, vaya a la glándula suprarrenal y la cápsula lejos de alrededor del exterior del riñón, de forma similar a pelar un plátano. Tenga cuidado de no dividir el riñón a la mitad, mientras se pelan, y asegúrese de no dañar el tejido renal por debajo de la cápsula. Retire con cuidado el resto de la cápsula, así como el uréter si todavía está conectado. Repita con el otro riñón.
- Utilice una pipeta de corte para colocar los riñones en un tubo de poliestireno de 5 ml de HBSS. Repita los pasos 2.2 a 2.4 por cada embrión. Los riñones se pueden juntar 8 por tubo. Con la eliminación práctica de la disección y la cápsula se llevará a 2-3 minutos de cada embrión.
3. La digestión enzimática de los riñones (todas las medidas a temperatura ambiente a menos se indique lo contrario)
- Retire la solución HBSS de tubos de 5 ml que contienen los riñones con una pipeta evitando cuidadosamente el contacto con los riñones. Inmediatamente añadir 1,5 ml de colagenasa A / pancreatina solución de digestión en el tubo de 5 ml que contienen los riñones antes de pasar a la siguiente muestra. Repita este procedimiento para cada tubo de los riñones.
- Se colocan los tubos con la enzima renal / digiere en un nutator en un pre-calentado incubadora a 37 ° C durante 15 minutos. 2 minutos antesfinalización de la digestión, añadir 3 l de DNasa (1 U / ml) a un nuevo tubo de poliestireno de 5 ml por cada digestión se realiza.
- Quite rápidamente la digestión de la incubadora, añadir 75 l de FBS y se invierte tres veces para mezclar. Deje reposar en el banco durante 2 minutos.
- La transferencia de 1,4 ml de la suspensión de células en el tubo de poliestireno de 5 ml que contienen DNasa (1 U / ml), dejando los restantes 0,2 ml de suspensión celular y los riñones por detrás. El extra 0,2 ml de solución se dejó contener impurezas tales como la matriz extracelular.
- Mezcle la suspensión de células / DNasa en una nutator en un 37 precalentado ° C incubadora durante 10 minutos.
- Eliminar rápidamente las suspensiones de células de la incubadora y la transferencia de cada uno a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Giro suspensiones celulares en microcentrífuga a 325 g durante 5 minutos.
- Quitar el sobrenadante de pellet de células y resuspender pellet en 1 ml de 5% de SFB / HBSS, pipeteando arriba y abajo 5 a 6 veces. Cap cada tubo antes de pasar a la siguiente muestra.
- Giro suspensiones celulares en una microcentrífuga a 325 g durante 5 minutos.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 0,5 ml de queratinocitos medio libre de suero (KSFM), con aditivos para cada tubo y el tubo de tapa antes de pasar a la siguiente muestra. Después de medio ha sido añadido a todos los tubos, suavemente resuspender cada pellet de células pipeteando arriba y abajo 5 a 6 veces con una micropipeta de 1 ml. Combine todas las suspensiones de células en un tubo de poliestireno de 5 fresca ml.
- Humedecer previamente dos de 40 micras de células colador-caps colocado en un tubo de 5 ml de poliestireno de fondo redondo con KSFM por muestra. Pase suspensiones celulares a través de un tapón del filtro mediante la transferencia de células con una micropipeta de 1 ml. Evite tocar el filtro con la punta de la pipeta. Recoger el filtrado y repetir filtración a través de la tapa del filtro de segundo. Quite la tapa del filtro de células y reemplazar con una nueva tapa de un tubo de poliestireno normal 5 ml.
- Recuento de células con un hemocitómetro o celulares cuenta-y las células de transferencia a los pozos de una placa de cultivo de la fibronectina recubierto con una densidad de 100.000-200.000 células por cm 2, según sea necesario diluir con KSFM con aditivos. Por lo general, se recupera aproximadamente 4.5x10 6 células de embriones por camada 10.
- Se incuban las células en un 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2.
- Permiten a las células para recuperarse y conectar de 2-4 horas en medio antes de la estimulación con reactivos adicionales. Estimular las células con el compuesto de interés de 1 a 48 horas. Purificar el ARN para análisis de PCR utilizando el kit Qiagen RNeasy Micro siguiendo las instrucciones del fabricante o siga las instrucciones para la inmunotinción con fluorescencia de las células.
4. Preparación de los reactivos para la fijación de las células y la inmunotinción
- Prepare un 4% PFA: Disuelva 4% de paraformaldehído en PBS (v / v) a 55 ° C con agitación periódica. Enfriar a temperatura ambiente antes de su uso. Esta solución es tóxico y debe ser desechado en recipientes de desperdicio.
- Prepare una solución de permeabilización mediante la adición de Triton X-100 a PBS para obtener una solución al 0,3% (v / v).
- Prepare una solución al 5% de bloqueo en PBS con suero de la misma especie que se utilizó para elevar el anticuerpo secundario que se utilizará. Por ejemplo, si se quiere detectar un anticuerpo de conejo contra el antígeno diana con un burro anti-conejo Alexa Fluor 568, prepare una solución de bloqueo con 5% de suero de burro. Almacenar a 4 ° C.
- Prepare una solución de anticuerpo primario mediante la adición de la concentración adecuada de anticuerpos contra el 5% de solución de bloqueo.
- Prepare una solución de anticuerpo secundario inmediatamente antes del uso. Añadir anticuerpo conjugado con fluoróforo a una concentración recomendada por el fabricante junto con la nuclear DAPI de contraste y otros marcadores de orgánulos como phalloidin de solución al 5% de bloqueo. Si el almacenamiento es necesario, mantener la solución en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso.
- Prepare 50% de glicerol / PBS solución (v / v) para el almacenamiento de células inmuno-. Por otra parte, Vectashield se puede utilizar.
5. La fijación de las células y la inmunotinción
- El siguiente protocolo se ha diseñado para la fijación y la tinción de NZCs en una placa de 24 pocillos. Los volúmenes indicados se refieren a un solo pozo. Los reactivos deben ser cuidadosamente pipeta durante todos los pasos para evitar la separación de las células, y la agitación de placas no se recomienda en las etapas de incubación.
- Retire con cuidado el medio con una micropipeta de 1 ml y añadir 0,5 ml de PFA al 4% de las células cultivadas adjunta. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente sin perturbaciones.
- Quitar el 4% PFA y añadir 0,5 ml por pocillo de solución de permeabilización. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Eliminar la solución de permeabilización y enjuague suavemente dos veces con 0,5 ml de PBS por aclarar.
- Añadir 0,5 ml de solución de bloqueo e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos.
- Retire la solución de bloqueo y añadir 0,225 ml de solución de anticuerpo primario.
- Incube a temperatura ambiente durante 2 horas o toda la noche a 4 ° C.
- Eliminar la solución de anticuerpo primario y ri suavementense dos veces con 0,5 ml de PBS por aclarar.
- Añadir 0,225 ml de solución de anticuerpo secundario. Incubar la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 60 minutos.
- Eliminar la solución de anticuerpo secundario y enjuague suavemente dos veces con 0,5 ml de PBS por aclarar.
- Añadir 0,3 ml de 50% de glicerol / PBS solución (v / v) o Vectashield suficiente para cubrir el fondo de la superficie también.
- Las celdas de imagen con microscopio de epifluorescencia o tienda envueltos en papel de aluminio a 4 ° C.
6. Resultados representante
Figura 1. NZCs fueron purificados a partir de E17.5 embriones, chapada a 200.000 células por cm 2 y se incuba a 37 ° C durante un total de 24 horas. Las células fueron fotografiadas por contraste de fases con un microscopio Leica DM IRB invertido antes de la tinción de inmunofluorescencia. (A) 20 veces vista fase de contraste de NZCs después de 24 horas en la cultura. (B) Las células fueron fijadas y teñidas con un conejo anti-PAX2 anticuerpo específico para células progenitoras de nefronas (rojo) y uno secundario Alexa Fluor 568 burro conjugado anti-conejo. Nota núcleos azules contrastados con DAPI. (C) Fase de 40X ver el contraste de un grupo de progenitores de nefronas (centro) después de 24 horas en la cultura. (D) de la imagen 40X NZCs aislado de LacZ + embriones de la cepa Foxd1 LacZ, que expresa β-galactosidasa bajo el control del promotor Foxd1. Foxd1 se expresa en la población de células del estroma en la zona nefrogénica de los riñones en desarrollo. Las células se tiñeron con la F-actina phalloidin marcador (Oregon verde primario conjugado), la nuclear tinte DAPI (azul) y de conejo anti-β-galactosidasa (secundaria - Alexa Fluor burro anti-conejo de 568) para la detección de las células del estroma Foxd1 + ( rojo).
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Discussion
En este protocolo se describe un método para aislar y cultivar células de la zona nefrogénica del riñón embrionario. Es el desarrollo de un método publicado inicialmente como parte de un estudio de los efectos de BMP7 tratamiento de las células de la zona nefrogénica (al blanco y otros., 2009). En el estudio inicial, una serie de experimentos para caracterizar los tipos de células representadas en la población NZC se llevaron a cabo. En pocas palabras, la purificación de NZCs de los periodistas genética para el estroma cortical (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini et al, 1996), los conductos colectores (Hoxb7 + / CRE; R26 rEYFP) (Srinivas et al, 2001;. Yu et al. , 2002), y la tapa mesénquima (BMP7 + / lacZ) (Godin et al., 1998) revela que aproximadamente el 35% de la cosecha se NZCs estroma cortical, el 52% son mesénquima tapa y que la recolección de la contaminación del conducto representa menos del 0,04%. Lineage experimentos de marcado con el BMP7 + / CRE; R26 rEYFP cepa (Oxburgh et al, 2004;.. Srinivas et al, 2001) mostró que aproximadamente el 10% de NZCs pueden ser las células del linaje mesénquima tapa que se han diferenciado y la pérdida de expresión BMP7 . Estudios de viabilidad con 7AAD mostró una tasa de supervivencia en NZCs aislados de aproximadamente el 95%. Recientemente hemos tenido éxito en la separación de subpoblaciones celulares en NZCs través de la clasificación de citometría de flujo. Sin embargo, la escasez de membrana asociada a los marcadores específicos de cada una de las subpoblaciones de la zona nefrogénica ha limitado estos análisis, y en la actualidad sólo las células derivadas de ratones con genes fluorescentes marcador es factible.
La eficacia de este protocolo depende en gran medida de la velocidad en el paso de la disección. Tanto la supervivencia celular y la capacidad de respuesta para aumentar la estimulación del factor de crecimiento cuando los riñones permanecen en HBSS por períodos más cortos de tiempo antes de la digestión enzimática. Un tiempo de preparación más corto por lo tanto los resultados tanto de la viabilidad celular superior y una respuesta más robusta. Además, se debe tener cuidado al retirar el sobrenadante después de girar la suspensión de células, como el pellet de células se altera fácilmente resulta en una pérdida considerable de células.
Desde los primeros trabajos de Clifford Grobstein describir la cultura de órganos embrionarios (Grobstein, 1953a; Grobstein, 1953b), el riñón ha sido un modelo de sistema de la organogénesis y la interacción entre las células epiteliales y mesenquimales en el desarrollo. Recientes estudios microanatómicas la expresión de genes han revelado una complejidad imprevista de los tipos de células dentro de cada uno de estos compartimentos celulares (Brunskill et al., 2008), y los métodos complementarios como la cultura NZC son necesarios para comprender la interrelación entre estas células durante la nefrogénesis. El objetivo final de nuestra investigación de células primarias es definir las condiciones en que las células nefrogénica zona puede ser por tiempo indefinido expandidas in vitro tanto para los estudios de nefrogénesis y el injerto en el adulto. El sistema de cultivo NZC es un paso importante hacia este objetivo, y estudios en curso en nuestro objetivo de laboratorio para definir los mecanismos de control del crecimiento de estas células.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el R01 DK078161 de NIDDK (LO), becas postdoctorales de la American Heart Association (AB), la Fundación Wenner-Gren de Suecia y Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Suecia (UB). Apoyo adicional fue proporcionada por el Centro Médico de Maine instalaciones centrales del Instituto de Investigación para la histopatología, Bioinformática y FACS (apoyado por 2P20RR18789-06) y el Fondo para el Animal MMCRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
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- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
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- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
