Neste relatório nós descrevemos um método para o isolamento e cultura do nicho de células progenitoras do rim do rato embrionárias que podem ser usadas para estudar vias de sinalização que regulam tronco / progenitoras células do rim em desenvolvimento. Estas células em cultura são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, que permite a manipulação eficiente das vias candidato.
Desenvolvimento embrionário dos rins tem sido extensivamente estudado tanto como um modelo para a interação epitélio-mesenquimal em organogênese e conhecer melhor as origens da doença renal congênita. Mais recentemente, a possibilidade de direcção ingênua células-tronco embrionárias para destinos nefrogênica tem sido explorado no campo emergente da medicina regenerativa. Estudos genéticos no rato identificaram vários caminhos necessários para o desenvolvimento do rim, e um catálogo global da transcrição de genes do órgão foi recentemente gerado http://www.gudmap.org/ , proporcionando reguladores candidato inúmeras funções essenciais de desenvolvimento. Organogênese dos rins de roedores pode ser estudado em cultura de órgão, e muitos relatórios têm usado essa abordagem para analisar os resultados de qualquer aplicação de proteínas candidato ou derrubando a expressão de genes candidatos usando siRNA ou morpholinos. No entanto, a aplicabilidade da cultura de órgãos, para o estudo de sinalização que regula a haste / diferenciação de células progenitoras contra renovação no rim em desenvolvimento é limitado como órgãos de cultura contêm uma matriz de difusão compacto extracelular limitando de macromoléculas e partículas de vírus. Para estudar a sinalização celular eventos que influenciam a haste / nicho de células progenitoras no rim, temos desenvolvido um sistema de célula primária que estabelece a zona nefrogênica ou nicho de células progenitoras do desenvolvimento do rim vivo ex isoladamente o indutor da diferenciação epitelial. Usando a digestão enzimática limitada, as células da zona nefrogênica pode ser seletivamente liberada de desenvolver rins em E17.5. Após filtração, essas células podem ser cultivadas como uma monocamada irregular utilizando condições otimizadas. Análise gene marcador demonstra que essas culturas contêm uma distribuição de tipos de células característica da zona nefrogênica in vivo, e que mantêm a expressão do gene marcador apropriado durante o período de cultura. Estas células são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, o que facilita muito o estudo do candidato-tronco / progenitoras efeitos regulador celular. Parâmetros de células biológicas básicas, como a proliferação e morte celular, bem como alterações na expressão de marcadores moleculares característicos de néfron tronco / progenitoras células in vivo pode ser utilizado com sucesso como os resultados experimentais. Trabalhos em curso no nosso laboratório, utilizando esta técnica celular romance principal objetivo de descobrir os mecanismos básicos que regem a regulação da auto-renovação versus diferenciação no néfron tronco / progenitoras das células.
Neste protocolo, descrevemos um método para isolar e cultivar células da zona nefrogênica do rim embrionário. É o desenvolvimento de um método inicialmente publicado como parte de um estudo dos efeitos da BMP7 tratamento em células da zona nefrogênica (Blank et al., 2009). No estudo inicial, uma série de experimentos para caracterizar os tipos de célula representada dentro da população NZC foram realizados. Resumidamente, a purificação da NZCs dos repórteres genética para o estroma cortical …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo R01 DK078161 de NIDDK (LO), bolsas de pós-doutorado da American Heart Association (AB), as Fundações Wenner-Gren da Suécia e Fysiografiska Kungliga Sällskapet, Lund, Suécia (UB). Apoio adicional foi fornecido pelo Maine Medical Center Research Institute instalações do núcleo de Histopatologia, Bioinformática e FACS (apoiado por 2P20RR18789-06) eo Biotério MMCRI.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
HBSS | Gibco | 14175 | ||
KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |