I denna rapport beskriver vi en metod för isolering och odling av stamceller nisch från embryonala musen njuren som kan användas för att studera signalvägar som reglerar stamceller / progenitorceller av utvecklingsländerna njure. Dessa odlade celler är mycket tillgänglig för små molekyler och rekombinant protein behandling och viktigare även för viral transduktion, som möjliggör en effektiv hantering av kandidat vägar.
Embryonala utvecklingen i njuren har studerats både som en modell för epitelceller-mesenkymala interaktion i organogenesen och få förståelse för ursprunget av medfödd njursjukdom. På senare tid har möjligheten att styra naiva embryonala stamceller mot nefrogen öden varit utforskas i det framväxande området regenerativ medicin. Genetiska studier på mus har identifierat flera vägar som krävs för njure utveckling, och en global katalog över gentranskription i orgeln har nyligen skapats http://www.gudmap.org/ , vilket ger många kandidat regulatorer av viktiga utvecklings-funktioner. Organbildande av gnagare njuren kan studeras i orgel kultur, och många rapporter har använt denna metod för att analysera resultaten av antingen tillämpa kandidat proteiner eller knacka ner uttrycket av gener med hjälp av siRNA eller morpholinos. Dock är tillämpningen av orgeln kultur för studier av signalering som reglerar stamceller / stamceller differentiering kontra förnyelse i utvecklingsländerna njure begränsad odlade organ innehåller en kompakt extracellulärmatrix att begränsa spridningen av makromolekyler och partiklar virus. För att studera cellsignalering händelser som påverkar stammen / stamcellstransplantation nisch i njuren har vi utvecklat en primär cell system som fastställer nefrogen zonen eller stamcellstransplantation nisch av utvecklingsländerna njure ex vivo i isolering från epiteliala inducerare av differentiering. Använda begränsat enzymatisk spjälkning kan nefrogen zon celler selektivt befrias från att utveckla njurarna vid E17.5. Efter filtrering kan dessa celler odlas som en oregelbunden cellslager använda optimerade förhållanden. Markörgen analys visar att dessa kulturer innehåller en fördelning av celltyper kännetecknande för nefrogen zonen in vivo, och att de upprätthåller lämpliga uttryck markörgen under kultur perioden. Dessa celler är mycket tillgänglig för små molekyler och rekombinant protein behandling och viktigare även för viral transduktion, vilket avsevärt underlättar studier av kandidat stam / progenitorceller effekter cell regulator. Grundläggande cell biologiska parametrar såsom proliferation och celldöd samt förändringar i uttryck av molekylära markörer kännetecknar nephron stam / progenitorceller in vivo kan med fördel användas som experimentella resultat. Pågående arbete i vårt laboratorium med hjälp av denna roman primärcell teknik syftar till att avslöja grundläggande mekanismer som styr regleringen av självförnyelse kontra differentiering nefronet stam / progenitorceller.
I detta protokoll beskriver vi en metod för att isolera och odla celler från nefrogen zon av embryonala njure. Det är utvecklingen av en metod som ursprungligen publicerades som en del av en studie av effekterna av BMP7 behandling på cellerna i nefrogen zonen (Blank et al., 2009). I den första studien var en serie experiment för att karakterisera celltyperna representerade inom NZC befolkningen genomförts. Kortfattat, rening av NZCs från genetiska reportrar för kortikala stroma (Foxd1 + / lacZ…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av R01 DK078161 från NIDDK (LO), postdoktorstipendium från American Heart Association (AB), Wenner-Gren Stiftelserna av Sverige och Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Sverige (UB). Ytterligare stöd kom från Maine Medical Center Research Institute core faciliteter för Histopatologi, bioinformatik och FACS (med stöd av 2P20RR18789-06) och MMCRI Djuranläggningen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
HBSS | Gibco | 14175 | ||
KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |