In dit rapport beschrijven we een methode voor de isolatie en de cultuur van de progenitor cel niche van de embryonale muis nier die gebruikt kan worden om signaalwegen reguleren van stam / voorlopercellen van de zich ontwikkelende nier te bestuderen. Deze gekweekte cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die een efficiënte manipulatie van de kandidaat-wegen mogelijk maakt.
Embryonale ontwikkeling van de nier is reeds uitgebreid bestudeerd, zowel als een model voor epitheliale-mesenchymale interactie in organogenese en om begrip van de oorsprong van aangeboren nierziekte te krijgen. Meer recent heeft de mogelijkheid van sturing naïeve embryonale stamcellen in de richting van nefrogene lot onderzocht in de opkomende gebied van de regeneratieve geneeskunde. Genetische studies in de muis hebben een aantal wegen die nodig zijn voor nier-ontwikkeling, en een globale catalogus van gentranscriptie in het orgel is onlangs gegenereerd http://www.gudmap.org/ , het verstrekken van een groot aantal kandidaat-regulatoren van essentiële ontwikkeling functies. Organogenese van het knaagdieren nier kan worden bestudeerd in orgelcultuur, en vele rapporten hebben gebruik gemaakt van deze aanpak om de resultaten te analyseren van een van beide het toepassen van de kandidaat-eiwitten of slopen van de expressie van genen met behulp van siRNA of morpholinos. Echter, is de toepasselijkheid van de orgelcultuur op de studie van signalering die stam / voorlopercellen celdifferentiatie versus vernieuwing regelt in de ontwikkelingslanden nier beperkt gekweekte organen bevatten een compacte extracellulaire matrix het beperken van de verspreiding van macromoleculen en virusdeeltjes. Naar de cel signaleren gebeurtenissen die de stam / voorlopercellen cell niche in de nieren hebben we een primaire cel systeem dat de nefrogene zone of stamceltransplantatie niche van de zich ontwikkelende nier ex vivo los van de epitheliale inductor van differentiatie stelt invloed te bestuderen. Met behulp van beperkte enzymatische vertering, kan nefrogene zone cellen worden selectief bevrijd van de ontwikkeling van de nieren bij E17.5. Na filtratie, kunnen deze cellen worden gekweekt als een onregelmatige monolaag met behulp van optimale condities. Markergen analyse toont aan dat deze culturen een verdeling van celtypen kenmerk van de nefrogene zone in vivo bevatten, en dat ze te onderhouden bijbehorende markering genexpressie tijdens de cultuur periode. Deze cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die sterk vergemakkelijkt de studie van de kandidaat-stam / voorlopercellen cel regulator effecten. Fundamentele celbiologische parameters zoals proliferatie en celdood, alsook veranderingen in de expressie van moleculaire merkers kenmerk van nefron stam / voorlopercellen cellen in vivo kunnen succesvol gebruikt worden als experimentele resultaten. De lopende werkzaamheden in ons laboratorium het gebruik van deze nieuwe primaire cel techniek heeft tot doel te ontdekken basis mechanismen voor de regulatie van zelfvernieuwing versus differentiatie in nefron stam / progenitorcellen.
In dit protocol beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur cellen uit de nefrogene zone van de embryonale nier. Het is de ontwikkeling van een methode in eerste instantie gepubliceerd als onderdeel van een studie van de effecten van BMP7 behandeling op de cellen van de nefrogene zone (Blank et al.., 2009). In de eerste studie werden een reeks experimenten om de cel te typen vertegenwoordigd in de NZC populatie karakteriseren uitgevoerd. Kortom, zuivering van NZCs van genetische verslaggevers voor de c…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door R01 DK078161 uit NIDDK (LO), postdoctorale fellowships van de American Heart Association (AB), de Wenner-Gren Grondslagen van Zweden en Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Zweden (UB). Aanvullende ondersteuning werd verleend door Maine Medical Center Research Institute kernfaciliteiten voor histopathologie, Bioinformatica en FACS (ondersteund door 2P20RR18789-06) en de MMCRI Animal Facility.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
HBSS | Gibco | 14175 | ||
KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |