Summary

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Published: April 22, 2011
doi:

Summary

In questo rapporto si descrive un metodo per l'isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione efficiente di percorsi candidato.

Abstract

Sviluppo embrionale del rene è stato ampiamente studiato sia come modello per l'interazione epitelio-mesenchimale in organogenesi e per guadagnare la comprensione delle origini della malattia renale congenita. Più recentemente, la possibilità di sterzo ingenuo cellule staminali embrionali verso destini nefrogenico è stato esplorato nel campo emergente della medicina rigenerativa. Studi genetici nel topo hanno identificato diversi percorsi necessari per lo sviluppo del rene, e un catalogo globale di trascrizione del gene nell'organo è stata recentemente generato http://www.gudmap.org/ , fornendo regolatori candidato numerose funzioni essenziali dello sviluppo. Organogenesi del rene roditori possono essere studiati in coltura d'organo, e le relazioni molti hanno utilizzato questo metodo per analizzare i risultati delle due proteine ​​applicare candidato o abbattere l'espressione di geni candidati utilizzando siRNA o Morpholinos. Tuttavia, l'applicabilità della cultura d'organo allo studio di segnalazione che regola staminali / differenziazione delle cellule progenitrici verso il rinnovo nel rene di sviluppo è limitato come organi colto contenere una diffusione compatto matrice extracellulare limitazione delle macromolecole e particelle virali. Per studiare la cellula di segnalazione eventi che influenzano le staminali / progenitrici di cellule di nicchia nel rene abbiamo sviluppato un sistema primario cella che stabilisce la zona nefrogenico o cellule progenitrici di nicchia del rene sviluppo ex vivo in isolamento dal induttore di differenziazione epiteliale. Utilizzando limitato digestione enzimatica, le cellule della zona nefrogenica può essere selettivamente liberato dallo sviluppo di reni a E17.5. A seguito di filtrazione, queste cellule possono essere coltivate come un monostrato irregolari con condizioni ottimizzate. Gene marcatore analisi dimostra che queste culture contengono una distribuzione dei tipi di cellule caratteristico della zona nefrogenico in vivo, e che dispongono di idonee espressione del gene marcatore durante il periodo di coltura. Queste cellule sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che facilita enormemente lo studio degli effetti delle cellule staminali candidato / progenitrici regolatore. Parametri cellula base biologici quali proliferazione e morte cellulare così come i cambiamenti nell'espressione di marcatori molecolari caratteristici della nefrone cellule staminali / progenitrici in vivo può essere usato con successo come risultati sperimentali. I lavori in corso nel nostro laboratorio utilizzando questa nuova tecnica cellula primaria mira a scoprire i meccanismi di base che regolano la regolamentazione di auto-rinnovamento contro nefrone differenziazione in cellule staminali / progenitrici.

Protocol

1. Reagenti per la preparazione digestione del rene 1,5 ml di 0,25% Collagenasi A (w / v) e soluzione 1% Pancreatina digerire (w / v) saranno necessari per l'estrazione di cellule zona nefrogenica (NZCs) da 8 E17.5 reni. Perché Pancreatina dura circa 2 ore per sciogliere a temperatura ambiente, basta digerire soluzione per il maggior numero di rene embrionale attesi dovrebbero essere fatte prima dell'esperimento. Preparare digerire soluzione in primo luogo l'aggiunta di 25 mg di Collagenasi A fos…

Discussion

In questo protocollo si descrive un metodo per isolare le cellule e la cultura dalla zona nefrogenico del rene embrionale. E 'lo sviluppo di un metodo inizialmente pubblicato come parte di uno studio degli effetti del trattamento BMP7 sulle cellule della zona nefrogenica (Blank et al., 2009). Nello studio iniziale, una serie di esperimenti per caratterizzare i tipi di cellule rappresentate all'interno della popolazione NZC sono stati condotti. In breve, la purificazione della NZCs dei giornalisti geneti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da R01 DK078161 da NIDDK (LO), borse di studio post-dottorato da American Heart Association (AB), il Wenner-Gren Fondazioni di Svezia e Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Svezia (UB). Ulteriore supporto è stato fornito dal Maine Medical Center Research Institute strutture di base per Istopatologia, Bioinformatica e FACS (supportato da 2P20RR18789-06) e il Fondo per animali MMCRI.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Watchmaker’s forceps #5   Roboz RS-4905 2 pairs required
Collagenase A   Roche 10 103 578 001 Wear mask
Porcine Pancreatin   Sigma P8096 Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg   Lonza 17-513F With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)   BioWhittaker 14-901E  
HBSS   Gibco 14175  
KSFM   Gibco 10724-011 without added growth factors
L-Glutamine 200mM   Sigma G7513 Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml   Sigma P4333 Use @ 1% v/v
Fibronectin   BD Biosciences 356008 Supplied as powder
24 well culture plate   Thermo Scientific 142485 Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca   Lonza 17-512F  
5mL polystyrene tubes   BD Biosciences 352235  
DNase (1 U/μl)   Invitrogen 18068-015 4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer   BD Biosciences 352235 w/cap and tube
Paraformaldehyde   Sigma P6148 Use @ 4 % w/v
Triton X100   VWR VW3929-2 Use @ 0.3 % v/v
PBS   Sigma P3813 Supplied as powder
Donkey serum   Jackson ImmunoResearch 017-000-121 Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2   Invitrogen 71-6000 Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal   MP Biomedicals 559762 Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin   Invitrogen O7466 Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568   Invitrogen A10042 Dilute 1:200
DAPI   Invitrogen D1306 Dilute 1:5000
Vectashield   Vector Laboratories H-1000  
Glycerol   EMD GX0185-6 Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit   Qiagen 74004 Use “DNase on column” protocol
Transfer pipettes, 3ml   BD Falcon 357575  

References

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Cite This Article
Brown, A. C., Blank, U., Adams, D. C., Karolak, M. J., Fetting, J. L., Hill, B. L., Oxburgh, L. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J. Vis. Exp. (50), e2555, doi:10.3791/2555 (2011).

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