Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo
Summary
In questo rapporto si descrive un metodo per l'isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione efficiente di percorsi candidato.
Abstract
Sviluppo embrionale del rene è stato ampiamente studiato sia come modello per l'interazione epitelio-mesenchimale in organogenesi e per guadagnare la comprensione delle origini della malattia renale congenita. Più recentemente, la possibilità di sterzo ingenuo cellule staminali embrionali verso destini nefrogenico è stato esplorato nel campo emergente della medicina rigenerativa. Studi genetici nel topo hanno identificato diversi percorsi necessari per lo sviluppo del rene, e un catalogo globale di trascrizione del gene nell'organo è stata recentemente generato http://www.gudmap.org/ , fornendo regolatori candidato numerose funzioni essenziali dello sviluppo. Organogenesi del rene roditori possono essere studiati in coltura d'organo, e le relazioni molti hanno utilizzato questo metodo per analizzare i risultati delle due proteine applicare candidato o abbattere l'espressione di geni candidati utilizzando siRNA o Morpholinos. Tuttavia, l'applicabilità della cultura d'organo allo studio di segnalazione che regola staminali / differenziazione delle cellule progenitrici verso il rinnovo nel rene di sviluppo è limitato come organi colto contenere una diffusione compatto matrice extracellulare limitazione delle macromolecole e particelle virali. Per studiare la cellula di segnalazione eventi che influenzano le staminali / progenitrici di cellule di nicchia nel rene abbiamo sviluppato un sistema primario cella che stabilisce la zona nefrogenico o cellule progenitrici di nicchia del rene sviluppo ex vivo in isolamento dal induttore di differenziazione epiteliale. Utilizzando limitato digestione enzimatica, le cellule della zona nefrogenica può essere selettivamente liberato dallo sviluppo di reni a E17.5. A seguito di filtrazione, queste cellule possono essere coltivate come un monostrato irregolari con condizioni ottimizzate. Gene marcatore analisi dimostra che queste culture contengono una distribuzione dei tipi di cellule caratteristico della zona nefrogenico in vivo, e che dispongono di idonee espressione del gene marcatore durante il periodo di coltura. Queste cellule sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che facilita enormemente lo studio degli effetti delle cellule staminali candidato / progenitrici regolatore. Parametri cellula base biologici quali proliferazione e morte cellulare così come i cambiamenti nell'espressione di marcatori molecolari caratteristici della nefrone cellule staminali / progenitrici in vivo può essere usato con successo come risultati sperimentali. I lavori in corso nel nostro laboratorio utilizzando questa nuova tecnica cellula primaria mira a scoprire i meccanismi di base che regolano la regolamentazione di auto-rinnovamento contro nefrone differenziazione in cellule staminali / progenitrici.
Protocol
Discussion
In questo protocollo si descrive un metodo per isolare le cellule e la cultura dalla zona nefrogenico del rene embrionale. E 'lo sviluppo di un metodo inizialmente pubblicato come parte di uno studio degli effetti del trattamento BMP7 sulle cellule della zona nefrogenica (Blank et al., 2009). Nello studio iniziale, una serie di esperimenti per caratterizzare i tipi di cellule rappresentate all'interno della popolazione NZC sono stati condotti. In breve, la purificazione della NZCs dei giornalisti geneti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da R01 DK078161 da NIDDK (LO), borse di studio post-dottorato da American Heart Association (AB), il Wenner-Gren Fondazioni di Svezia e Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Svezia (UB). Ulteriore supporto è stato fornito dal Maine Medical Center Research Institute strutture di base per Istopatologia, Bioinformatica e FACS (supportato da 2P20RR18789-06) e il Fondo per animali MMCRI.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
| Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
| HBSS | Gibco | 14175 | ||
| KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
| 24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
| Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
| PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |
References
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