Summary
Точным методом оценки гибели клеток описывается. Протокол улучшает обычных Аннексин В / пропидий йодида (PI) протоколов, которые отображают до 40% ложно-положительных событий в клеточных линий и первичных клеток от широкого круга животных моделях.
Abstract
Исследования клеточного апоптоза было существенное влияние с момента появления проточной цитометрии основе методов. Пропидий йодида (PI) широко используется в сочетании с Аннексин V, чтобы определить, клетки жизнеспособны, апоптоза, или некротических через различия в плазме целостность мембраны и проницаемость 1,2. Аннексин V / PI протокол широко используется подход к изучению апоптоза клеток 3. П. И. используется чаще, чем у других ядерных пятна, потому что это экономично, стабильный и хороший показатель жизнеспособности клеток, основанный на его способности, чтобы исключить красителя в живых клетках 4,5. Способность П. И. войти клеток зависит от проницаемости мембраны; PI не окрашивает жить или в начале апоптоза клеток из-за присутствия нетронутыми плазматической мембраны 1,2,6. В конце апоптоза и некроза клеток, целостность плазмы и ядерной мембраны уменьшается 7,8, что позволяет PI проходить через мембраны, интеркалировать в нуклеиновые кислоты, а также отображать красной флуоресценции 1,2,9. К сожалению, мы обнаружили, что обычные Аннексин V / PI протоколов привести к значительным числом ложных положительных событий (до 40%), которые связаны с П. И. окрашивания РНК в цитоплазматических отсека 10. Первичные элементы и клеточных линий в широком диапазоне моделей на животных затронуты, с крупными ячейками (ядерное топливо: цитоплазматические отношения <0,5), демонстрирующий высшую возникновения 10. При этом, мы демонстрируем изменение Аннексин V / PI метод, который обеспечивает значительное улучшение оценки гибели клеток по сравнению с обычными методами. Этот протокол использует изменения в клеточной проницаемости в процессе клеточного крепления к содействию вступления РНКазы в клетки следующие окрашивания. Оба времени и концентрации РНКазы были оптимизированы для удаления цитоплазматической РНК. Результатом является значительное улучшение по сравнению с обычными Аннексин V / PI протоколов (<5% событий с окрашиванием цитоплазмы PI).
Protocol
Эта процедура может быть выполнена в 500 мкл силиконовая трубки или 6 мл полистирола с круглым дном FACS труб. Последний обычно используется при проведении анализа жизнеспособности в сочетании с другими процедурами. Все объемы указаны только для 6 мл полистирола с круглым дном FACS труб. Для 500 мкл силиконовая трубки, свести все объемы на 1 / 5.
Оптимальная концентрация для анализа потока цитометрии в 2-4 х 10 6 клеток на 200 мкл объема. Сотовые потери могут возникнуть в результате этой процедуры, и таким образом, мы рекомендуем, чтобы каждый образец состоит из 4 х 10 6 клеток в начале процедуры.
1. Сотовые подготовка
- Урожай клеток - ссылаться на конкретные процедуры для соответствующих клеточных линий или первичного выделения клеток.
- Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 2 мл 1 фосфат х солевым буфером (PBS) - / - (без кальция, магния нет).
- Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл 1 х Аннексин V буфера для связывания.
- Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания.
2. Применение Аннексин V / PI пятно
- Добавить Аннексин V в соответствии с рекомендациями производителя [например, 5 мкл Аннексин V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
- Инкубируйте труб в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Добавить 100 мкл 1 х Аннексин V обязательным буфер для каждой реакции трубки. Там должно быть около 200 мкл в каждую пробирку.
- Добавьте 4 мкл PI (Sigma, кат № Р-4864-10 мл), который был разбавленным 1:10 в 1 х Аннексин V связывающем буфере (т.е. 1 мкл PI с 9 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания). Это приведет к окончательной концентрации PI 2 мкг / мл в каждом образце.
- Инкубируйте труб в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Добавить 500 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания мыть клетки.
- Центрифуга образцов при 335 х г в течение 10 минут и сцедить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 500 мкл 1 х Аннексин V буфера для связывания и 500 мкл 2% формальдегида для создания 1% формальдегида (фиксатором) решение. Смешайте трубы, осторожно стряхивая.
- Fix образцы на льду в течение 10 минут. Кроме того, образцы могут храниться в течение ночи при 4 ° С в темноте. Если последний метод был выбран, удостоверьтесь, чтобы быть последовательным во всех трубах помечены Аннексин V / PI (в том числе компенсации управления).
- Добавьте 1 мл 1 х PBS - / - для каждого образца и аккуратно перемешать, щелкая.
- Пробирки центрифужные в 425 х г в течение восьми минут и сцедить супернатант.
- Повторите шаги с 2.10 и 2.11.
- Ресуспендируют гранул, щелкая трубки.
- Добавить 16 мкл разбавленной 1:100 РНКазы (Sigma, R4642), чтобы дать конечной концентрации 50 мкг / мл. Инкубировать 15 минут при температуре 37 ° C.
- Добавьте 1 мл 1 х PBS - / - и аккуратно перемешать, щелкая.
- Пробирки центрифужные в 425 х г в течение восьми минут.
- Образцы теперь готовы для анализа. Кроме того, образцы можно использовать для последующих шагов, если окрашивание Аннексин / PI окрашивание выполняется параллельно с другими процедурами.
3. Представитель Результаты:
Примеры типов клеток и клеточных линий, которые имеют различные степени ложно-положительных П. И. окрашивания показаны на рисунке 1. Для учета ложно-положительных событий, клетки фиксируют, а затем обрабатывают РНКазы А. Это приводит к значительному уменьшению количества ложно-положительных событий, по сравнению с клетками, которые не прошли РНКазы лечения (рис. 2В). Рис 2С показывает, представитель изображений клеток, подвергшихся РНКазы лечения, по сравнению с клетками, которые не имеют лечения РНКазы. Рисунок 3 показывает, как изменение Аннексин V / PI протокол, с фиксацией и шаги РНКазы лечения, улучшает обычные протоколы, ограничивая число ложно-положительных событий окрашивания.
Рисунок 1. Обычные протоколы йодида пропидий окрашивания привести к значительным числом ложных положительных событий. Ранее мы оценивали степень ложноположительных окрашиванию через первичные элементы в широком диапазоне моделей на животных, а также в различных клеточных линиях 10. Представитель изображения показывают степень ложных срабатываний окрашивания в три уникальные клеточные популяции (обычно используются клеточные линии - RAW макрофагов и два первичных клеток - костного мозга мышиных макрофагов (БММ) и золотая рыбка первичной макрофагов почек (ПКМ)). Правда позитивных событий дисплей ожидается совместное локализации между ИП и DRAQ5 в ядерном отсеке (желтые области изображают колокализации между ИП и DRAQ5). DRAQ5 очень membraпе проницаемой краситель, который точно пятна ядерной отсеке и в живых и мертвых клеток 10,11,12. Для облегчения визуального определения колокализации DRAQ5 пятна был дан зеленый pseudocolour.
Рисунок 2. Более точное значение PI окрашивание ядер. () Мы оценили точность П. И. окрашивание ядер в зависимости от степени сходства ряда хорошо известных ядерных пятна (BrdU, 7-AAD и DAPI), чтобы DRAQ5. BrdU представляет собой синтетический нуклеозид, которая включена в ДНК пролиферирующих клеток, и как таковая будет только пятно в ядерном отсеке. 7-AAD имеет высокое сродство к ДНК и, как и ИП, не может пересечь нетронутыми плазматической мембране. DAPI также имеет сильное сродство к ДНК и является наиболее часто используемых ядерных пятном в люминесцентной микроскопии. Степень сходства было> 99% в период с BrdU, 7-AAD, DAPI и DRAQ5, выделяя их способность точно пятно клеточного ядра в RAW 264,7 макрофагов. В отличие от цитоплазматического окрашивания П. И. на основе традиционных протоколов приводит к заметному снижению процента сходство окраски по отношению к DRAQ5. (Б) Подобные результаты наблюдаются в двух первичных элементов протестированы: мышиных макрофагов костного мозга (БММ) и золотая рыбка первичной макрофагов почек (ПКМ). Включение 50 мкг / мл РНКазы на определенном этапе в течение окрашивания процедура удаляет неядерных П. И. окрашивания и значительно увеличивает степень сходства по отношению к DRAQ5 окрашивания. (C) представитель образы первичных макрофагов почек показать степень сходства для клеток с и без лечения РНКазы. Для облегчения визуального определения различия между процедурами, DRAQ5 был дан зеленый. Желтый областях изображают колокализации между BrdU и DRAQ5, П. И. и DRAQ5.
Рисунок 3. Измененный Аннексин V / PI значительно снижает ложные апоптоз / некротические события. Первичная золотая рыбка почек макрофагов (ПКМ) были окрашены обычной и модифицированной Аннексин V / PI протоколов. Диаграммы рассеяния изобразить Аннексин V / PI пятна в золотой рыбки ПКМ. Рассеяния слева показывает обычные Аннексин V / PI окрашивания (без РНКазы) из ПКМ клеток. Рассеяния справа показывает ПКМ клеток, окрашенных изменение Аннексин V / PI протокол (с РНКазы). Помимо результатов РНКазы в выраженное снижение PI окрашивания из-за удаления ложных положительных пятен. ПКМ клетки были затем проанализированы на основе различных групп населения в рамках культур-предшественников ранней (EP), моноцитов (моно) и зрелых макрофагов (Мат Mac). Сокращение числа позитивных событий П.И., из-за удаления ложных положительных событий является более выраженным в крупных зрелых клеток макрофагов, чем в небольших ранних клеток-предшественников. Выводы, основанные на традиционных протоколов бы ошибочно предложил положительную корреляцию в клеточной смерти для более зрелых подмножества макрофагов.
Discussion
Аннексин V / PI протокол, представленные здесь, модифицированной версией обычных протоколов и принимает во внимание наличие РНК в цитоплазме, которая также имеет высокое сродство к PI. Внедрение РНКазы (50 мкг / мл) после шага 1% формальдегида фиксации в конце процедуры окрашивания значительно улучшает точность ядерное окрашивание PI. Каких-либо негативных эффектов наблюдается в ядерных окрашивания ИП или плазматической мембраны Аннексин V окрашивания. Без РНКазы лечения, до 40% от PI пятно результаты могут привести к ложным положительным событиям, что приводит к потенциально значительные и негативное влияние на течение выводы 10.
Наши изменение Аннексин V / PI окрашивания протокол является простым и эффективно используется в широком диапазоне типов клеток (Первичные элементы: мышиные костного мозга макрофагами и спленоцитов; свиной клетки резидент легких, альвеолярных макрофагов легких, мезентериальных лимфатических узлов изоляты, лейкоцитов периферической крови , спленоцитов, клетки куриного бластодерма; золотая рыбка первичной макрофагов почек; карп лейкоцитов периферической крови; Клеточные линии: RAW 264,7 макрофагов, Т-клетки Jurkat, свиней 3D4/31 макрофаги, CCL-71 фибробласты золотые рыбки плавник, 3B11 сома В-клетки 10). Важно отметить, что клетки дифференциально пострадавших от ложных срабатываний окрашивания П.И., с первичной клетки в целом, имеющие большее количество ложных положительных событий 10. Различия ложноположительных окрашиванию PI среди этих клеточных популяций может быть частично связано с различиями в размер ячейки, но может также возникнуть в результате различий в содержании РНК. Таким образом, включение эта процедура особенно актуальна для экспериментальных систем, которые используют, в частности, клетки проходят генотоксического стресса, клетки, обработанные клеточного цикла препараты, такие как тимидина или гидроксимочевины, вирусно-инфицированные клетки, а также исследования на эмбриональных клетках, где развитие прогрессии характеризуется дискретные изменения в клеточном синтезе РНК.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано естественных наук и инженерного совета Канады (NSERC) исследовательский грант и Альберта сельского хозяйства Финансирование консорциума предоставлять DRB. AMR поддерживается посредством NSERC Ванье канадской высшей стипендии Университета Альберты ассистентом преподавания и королева Елизавета II выпускников стипендии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
