Summary
Een nauwkeurige methode voor de beoordeling van de cel dood is beschreven. Het protocol verbetert conventionele Annexine V / propidiumjodide (PI) protocollen, die up display tot 40% vals-positieve gebeurtenissen in cellijnen en primaire cellen van een breed scala van diermodellen.
Abstract
Studies van cellulaire apoptose zijn aanzienlijk beïnvloed sinds de invoering van flowcytometrie-gebaseerde methoden. Propidiumjodide (PI) wordt veel gebruikt in combinatie met Annexine V om te bepalen of cellen zijn levensvatbaar, apoptotische of necrotische door verschillen in de plasma membraan integriteit en permeabiliteit 1,2. De Annexine V / PI-protocol is een veel gebruikte benadering voor het bestuderen van apoptotische cellen 3. PI is vaker dan andere nucleaire vlekken gebruikt omdat het economisch, stabiel en een goede indicator van de levensvatbaarheid van de cel, op basis van haar vermogen om kleurstof uit te sluiten in levende cellen 4,5. Het vermogen van PI naar een cel in te voeren is afhankelijk van de permeabiliteit van het membraan, PI maakt geen vlekken woont of vroege apoptotische cellen als gevolg van de aanwezigheid van een intacte plasmamembraan 1,2,6. Aan het eind van apoptotische en necrotische cellen, de integriteit van het plasma en de nucleaire membranen daalt 7,8, waardoor PI te passeren door de membranen, in nucleïnezuren intercaleren, en rode fluorescentie 1,2,9 weer te geven. Helaas vinden we dat de conventionele Annexine V / PI-protocollen leiden tot een aanzienlijk aantal vals positieve gebeurtenissen (tot 40%), die worden geassocieerd met PI kleuring van RNA in de cytoplasmatische compartiment 10. Primaire cellen en cellijnen in een breed scala van diermodellen worden beïnvloed, met grote cellen (nucleair: cytoplasmatische ratio <0,5) met de hoogste gebeurtenis 10. Hierin tonen we een aangepaste Annexine V / PI methode die een significante verbetering voor de beoordeling van celdood in vergelijking met conventionele methoden biedt. Dit protocol maakt gebruik van veranderingen in de cellulaire permeabiliteit tijdens de celdeling de vaststelling dat de instroming van RNase A te bevorderen in de cellen na kleuring. Zowel de timing en de concentratie van RNase A zijn geoptimaliseerd voor het verwijderen van cytoplasmatische RNA. Het resultaat is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van conventionele Annexine V / PI-protocollen (<5% evenementen met cytoplasmatisch PI kleuring).
Protocol
Deze procedure kan worden uitgevoerd in 500 pi gesiliconiseerde buizen of 6 mL polystyreen ronde bodem FACS buizen. Dit laatste is gewoonlijk gebruikt bij het uitvoeren van levensvatbaarheid in combinatie met andere procedures. Gegeven alle volumes zijn voor 6 mL polystyreen ronde bodem FACS buizen. Voor 500 pL gesiliconiseerde buizen, verminderen alle volumes met 1 / 5.
De optimale concentratie voor flowcytometrie-analyse is 2-4 x 10 6 cellen per 200 pi volume. Cel verlies kan het gevolg zijn van deze procedure en dus raden we aan dat elk monster bestaat uit 4 x 10 6 cellen bij het begin van de procedure.
1. Celpreparaat
- Oogst cellen - wordt verwezen naar specifieke procedures voor overeenkomstige cellijnen of primaire cel isolaties.
- Centrifugeer monsters op 335 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant.
- Resuspendeer cellen in 2 ml 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) - / - (geen calcium, magnesium niet).
- Centrifugeer monsters op 335 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant.
- Resuspendeer cellen in 1 ml 1 x Annexine V binding buffer.
- Centrifugeer monsters op 335 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant.
- Resuspendeer cellen in 100 ul 1 x Annexine V binding buffer.
2. Toepassing van Annexine V / PI Stain
- Voeg Annexine V volgens de aanbevelingen van de fabrikant [bijv. 5 microliter Annexine V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)].
- Incubeer buizen in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 ul van 1 x Annexine V binding buffer om elke reactie buis. Er moet ongeveer 200 pl in elke buis zijn.
- Voeg 4 ul van PI (Sigma, Cat # P-4864-10 ml) dat werd 1:10 verdund in 1 x Annexine V binding buffer (dat wil zeggen een pL PI met 9 il 1 x Annexine V binding buffer). Dit levert een uiteindelijke PI concentratie van 2 ug / ml in elk monster.
- Incubeer buizen in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 500 ul 1 x Annexine V binding buffer om de cellen te wassen.
- Centrifugeer monsters op 335 x g gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant.
- Resuspendeer cellen in 500 pi 1 x Annexine V bindingsbuffer en 500 pL 2% formaldehyde tot een 1% formaldehyde (fixatief) oplossing te creëren. Meng buizen door zacht te vegen.
- Fix monsters op ijs gedurende 10 minuten. Als alternatief kan samples 's nachts worden opgeslagen bij 4 ° C in het donker. Als deze laatste methode wordt gekozen, zorg ervoor dat consistent zijn in alle buizen voorzien van Annexine V / PI (inclusief vergoeding controles).
- Voeg 1 ml 1 x PBS - / - aan elk monster en meng voorzichtig door de knop.
- Centrifugebuis bij 425 x g acht minuten en decanteer de bovenstaande vloeistof.
- Herhaal stap 2.10 en 2.11.
- Resuspendeer pellet door de knop de buis.
- Voeg 16 ul van 1:100 verdund RNase A (Sigma, R4642), tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml te geven. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 1 ml 1 x PBS - / - en meng voorzichtig door de knop.
- Centrifugebuis bij 425 x g gedurende acht minuten.
- Monsters zijn nu klaar om te worden geanalyseerd. Als alternatief kunnen monsters worden gebruikt voor de volgende kleuren stappen als Annexine / PI kleuring wordt uitgevoerd in parallel met andere procedures.
3. Representatieve resultaten:
Voorbeelden van celtypen en cellijnen die verschillende graden van vals-positieve PI kleuring zijn weergegeven in figuur 1. Om rekening te houden voor de vals-positieve gebeurtenissen, werden de cellen vast en vervolgens behandeld met RNase A. Dit resulteert in een significante daling van het aantal fout-positieve gebeurtenissen, in vergelijking met cellen die niet ondergaan RNase behandeling (Figuur 2B). Figuur 2C toont representatieve beelden van cellen die RNase behandeling onderging, in vergelijking met cellen die geen RNase behandeling was. Figuur 3 laat zien hoe de gewijzigde Annexine V / PI-protocol, met fixatie en RNase behandeling stappen, verbetert de conventionele protocollen door beperking van het aantal fout-positieve kleuring evenementen.
Figuur 1. Conventionele propidiumjodide kleuring protocollen leiden tot een aanzienlijk aantal vals-positieve gebeurtenissen. We hebben eerder de omvang van vals positieve kleuring in primaire cellen geëvalueerd in een breed scala van diermodellen als in een verscheidenheid van cellijnen 10. Representatieve beelden tonen de omvang van vals-positieve kleuring in drie unieke celpopulaties (een veel gebruikte cellijn - RAW macrofagen en twee primaire cellen - beenmerg van muizen macrofagen (BMM) en de goudvis primaire nieren macrofagen (PKM)). Echte positieve gebeurtenissen weer te geven van de verwachte co-localisatie tussen de PI en DRAQ5 binnen de nucleaire compartiment (gele gebieden weer te geven colocalization tussen PI en DRAQ5). DRAQ5 is zeer membrane doorlaatbaar kleurstof die nauwkeurig vlekken nucleaire compartiment zowel in levende en dode cellen 10,11,12. Voor eenvoudiger visuele bepaling van colocalization DRAQ5 vlek kreeg een groen pseudocolour.
Figuur 2. Verbetering van de nauwkeurigheid van de PI nucleaire kleuring. (A) Wij hebben de nauwkeurigheid van de PI nucleaire kleuring op basis van mate van overeenstemming van een aantal goed gekarakteriseerde nucleaire vlekken (BrdU, 7-AAD en DAPI) naar DRAQ5. BrdU is een synthetische nucleoside die is ingebouwd in het DNA van delende cellen, en als zodanig zal alleen vlek binnen de nucleaire compartiment. 7-AAD heeft een hoge affiniteit voor DNA en, vergelijkbaar met PI, kan niet over een intact plasmamembraan. DAPI heeft ook een sterke affiniteit voor DNA en is de meest gebruikte nucleaire vlek in fluorescentie microscopie. De mate van overeenstemming was> 99% tussen BrdU, 7-AAD, DAPI en DRAQ5, met de nadruk hun vermogen om nauwkeurig vlekken op de celkern in RAW 264,7 macrofagen. In tegenstelling, cytoplasmatische PI kleuring, gebaseerd op conventionele protocollen leidt tot een duidelijke afname in procenten gelijkenis van vlekken ten opzichte van DRAQ5. (B) Vergelijkbare resultaten worden waargenomen in de twee geteste primaire cellen: muizen beenmerg macrofagen (BMM) en de goudvis primaire nieren macrofagen (PKM). Incorporatie van 50 ug / ml RNase A op specifieke fase binnen de kleuringsprocedure verwijdert niet-nucleaire PI kleuring en verhoogt mate van overeenstemming ten opzichte van DRAQ5 vlekken. (C) Afbeeldingen slechts ter illustratie van de primaire nier macrofagen tonen de mate van overeenstemming voor cellen met en zonder RNase behandeling. Voor eenvoudiger visuele bepaling van de verschillen tussen de behandelingen, was DRAQ5 krijgt een groen. Gele gebieden verbeelden colocalization tussen BrdU en DRAQ5, en PI en DRAQ5.
Figuur 3. Modified Annexine V / PI vermindert valse apoptose / necrotische evenementen. Primaire goudvissen nier macrofagen (PKM) werden gekleurd met conventionele en gemodificeerde Annexine V / PI protocollen. Scatterplots verbeelden de Annexine V / PI vlek in goudvissen PKM. De scatterplot aan de linkerkant toont conventionele Annexine V / PI kleuring (geen RNase) van PKM cellen. De scatterplot aan de rechterkant toont PKM-cellen gekleurd met de gewijzigde Annexine V / PI-protocol (met RNase). De toevoeging van RNase resulteert in een duidelijke vermindering van de PI kleuring als gevolg van het verwijderen van vals-positieve vlekken. PKM cellen werden vervolgens geanalyseerd op basis van verschillende populaties binnen de cultuur-vroege voorlopers (EP), monocyten (mono) en rijpe macrofagen (Mat mac). De vermindering van het aantal positieve PI evenementen, te wijten aan de verwijdering van vals-positieve gebeurtenissen is meer uitgesproken in grote rijpe macrofaag-cellen dan in de kleinere begin van de stamcellen. Conclusies gebaseerd op conventionele protocollen zouden ten onrechte hebben gesuggereerd een positieve correlatie in cellulaire dood voor de rijpere macrofagen subsets.
Discussion
De Annexine V / PI-protocol hier gepresenteerde is een aangepaste versie van conventionele protocollen en houdt rekening met de aanwezigheid van RNA in het cytoplasma die ook een hoge affiniteit voor PI. Introductie van RNase A (50 ug / mL) na een 1% formaldehyde fixatie stap laat in de kleuringsprocedure verbetert de nauwkeurigheid van de nucleaire PI kleuring. Geen negatieve effecten zijn waargenomen in nucleaire PI vlekken of plasmamembraan Annexine V vlekken. Zonder RNase Een behandeling kan tot 40% van de PI vlek resultaten leiden tot vals positieve gebeurtenissen, wat leidt tot een potentieel significante en negatieve invloed op de downstream conclusies 10.
Onze aangepaste Annexine V / PI kleuringsprotocol is simpel en effectief is gebruikt in een breed scala van celtypen (primaire cellen: muizen beenmerg macrofagen en splenocyten; varkens long inwoner cellen-, long-alveolaire macrofagen, mesenteriale lymfeklieren isoleert, perifere bloed leukocyten , splenocyten; kip blastoderm cellen; goudvis primaire nieren macrofagen; karper perifere bloed leukocyten; Cellijnen: RAW 264,7 macrofagen, Jurkat T-cellen, varkens 3D4/31 macrofagen, CCL-71 goudvis fin fibroblasten, 3B11 meerval B-cellen 10). Het is belangrijk op te merken dat verschillend cellen worden beïnvloed door vals positieve PI kleuring, met primaire cellen over het algemeen een groter aantal valse positieve gebeurtenissen 10. De verschillen vals-positieve PI kleuring onder deze cellulaire populaties kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan verschillen in celgrootte, maar kan ook het gevolg van verschillen in RNA content. Als zodanig, integratie van deze procedure is met name relevant voor experimentele systemen die gebruik maken van onder andere cellen die genotoxische stress, cellen behandeld met de celcyclus drugs, zoals thymidine of hydroxyurea, viraal-geïnfecteerde cellen, en studies over embryonale cellen waar de ontwikkeling progressie wordt gekenmerkt door discrete veranderingen in de cellulaire RNA-synthese.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door een Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) onderzoek te verlenen en een Alberta Landbouw Financiering Consortium te verlenen aan DRB. AMR wordt ondersteund door een NSERC Vanier Canadese Graduate Scholarship, een Universiteit van Alberta onderwijs assistentschap en een koningin Elizabeth II afstuderen beurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
