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Summary

Une méthode précise pour l'évaluation de la mort cellulaire est décrite. Le protocole améliore conventionnels annexine V / iodure de propidium (PI) des protocoles, qui affichent jusqu'à 40% de faux positifs des événements dans des lignées cellulaires et cellules primaires à partir d'un large éventail de modèles animaux.

Abstract

Les études de l'apoptose cellulaire ont été significativement impacté depuis l'introduction de la cytométrie de flux basé sur des méthodes. L'iodure de propidium (PI) est largement utilisé en conjonction avec l'annexine V afin de déterminer si les cellules sont viables, apoptose, ou nécrotiques par des différences dans l'intégrité de la membrane plasmique et ^1,2 perméabilité. L'annexine V / PI protocole est une méthode couramment utilisée pour étudier les cellules apoptotiques ^3. PI est utilisé plus souvent que d'autres colorants nucléaires, car il est économique, stable et un bon indicateur de la viabilité cellulaire, basée sur sa capacité à exclure les colorants dans les cellules vivantes ^4,5. La capacité de la PI pour entrer dans une cellule dépend de la perméabilité de la membrane; PI ne tache pas vivre ou début cellules apoptotiques en raison de la présence d'une membrane plasmique intacte ^1,2,6. À la fin de cellules apoptotiques et nécrotiques, l'intégrité du plasma et les membranes nucléaires diminue ^7,8, permettant PI à traverser les membranes, s'intercaler dans les acides nucléiques, et afficher une fluorescence rouge ^1,2,9. Malheureusement, nous constatons que conventionnelles annexine V / PI protocoles conduire à un nombre important de faux événements positifs (jusqu'à 40%), qui sont associés à coloration PI de l'ARN dans le compartiment cytoplasmique ^10. Les cellules primaires et des lignées cellulaires dans un large éventail de modèles animaux sont touchés, avec de grandes cellules (nucléaire: les ratios cytoplasmique <0,5) montrant la plus haute fréquence ^10. Ici, nous démontrons une modification annexine V / PI méthode qui apporte une amélioration significative pour l'évaluation de la mort cellulaire par rapport aux méthodes conventionnelles. Ce protocole prend avantage de modifications de la perméabilité cellulaire au cours de la cellule de fixation à promouvoir l'entrée de la RNase A dans les cellules après coloration. Tant le moment et la concentration de la RNase A ont été optimisés pour l'enlèvement de l'ARN cytoplasmique. Le résultat est une amélioration significative par rapport conventionnels annexine V / PI protocoles (<5% des événements avec coloration PI cytoplasmique).

Protocol

Cette procédure peut être effectuée dans 500 ul des tubes siliconés ou 6 ml en polystyrène à fond rond tubes FACS. Ce dernier est normalement utilisée lors de la réalisation d'analyses de viabilité en conjonction avec d'autres procédures. Tous les volumes sont donnés à 6 ml tubes en polystyrène FACS à fond rond. Pour 500 ul des tubes siliconés, de réduire l'ensemble des volumes de 1 / 5. La concentration optimale pour l'analyse de cytométrie en flux est de 2-4 x 10 6 cellules par 200 le volume ul. La perte de cellules peuvent résulter de cette procédure et donc nous recommandons que chaque échantillon se compose de 4 x 10 6 cellules au début de la procédure. 1. Préparation des cellules Récolte des cellules – se référer à des procédures spécifiques pour les lignées de cellules correspondant ou des isolations de cellules primaires. Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. Resuspendre les cellules dans 2 ml de phosphate 1 x saline tamponnée (PBS) – / – (pas de calcium, de magnésium aucune). Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon 1 x V annexine contraignant. Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon 1 x V annexine contraignant. 2. Application de l'annexine V / PI Stain Ajouter annexine V, conformément aux recommandations du fabricant [par exemple, 5 uL annexine V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. Incuber les tubes dans l'obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter 100 ul d'une mémoire tampon annexine V x contraignant pour chaque tube de réaction. Il devrait y avoir environ 200 uL dans chaque tube. Ajouter 4 pi de PI (Sigma, Cat # P-4864-10 ml) qui a été diluée à 1:10 dans une mémoire tampon annexine V x contraignant (1 PI uL avec 9 x 1 ul annexine V tampon de liaison). Cela produira une concentration finale de PI 2 ug / ml dans chaque échantillon. Incuber les tubes dans l'obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter 500 ul 1 x annexine V tampon de liaison pour laver les cellules. Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon 1 x V annexine contraignant et 500 uL de formaldéhyde à 2% pour créer une solution à 1% de formaldéhyde (fixateur). Mélanger en tapotant doucement les tubes. Fixer les échantillons sur la glace pendant 10 minutes. Alternativement, les échantillons peuvent être conservés une nuit à 4 ° C dans l'obscurité. Si cette dernière méthode est choisie, assurez-vous d'être cohérent dans tous les tubes étiquetés avec l'annexine V / PI (y compris les contrôles de compensation). Ajouter 1 mL 1 x PBS – / – pour chaque échantillon et mélanger doucement en tapotant. Centrifuger les tubes à 425 x g pendant huit minutes et décanter le surnageant. Répétez les étapes 2.10 et 2.11. Resuspendre le culot en feuilletant le tube. Ajouter 16 uL d'dilué à 1:100 Une RNase (Sigma, R4642) pour donner une concentration finale de 50 ug / ml. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. Ajouter 1 mL 1 x PBS – / – et mélanger doucement en tapotant. Centrifuger les tubes à 425 x g pendant huit minutes. Les échantillons sont maintenant prêts à être analysés. Alternativement, les échantillons peuvent être utilisés pour les étapes ultérieures, si coloration annexine / PI coloration est effectuée en parallèle avec d'autres procédures. 3. Les résultats représentatifs: Exemples de types de cellules et de lignées cellulaires qui présentent divers degrés de coloration PI faux-positifs sont présentés dans la figure 1. Pour tenir compte des événements de faux-positifs, les cellules ont été fixées puis traités à la RNase A. Il en résulte une diminution significative du nombre de faux positifs événements, comparativement aux cellules qui n'ont pas subi un traitement RNase (figure 2B). La figure 2C montre des images représentant des cellules qui ont subi un traitement RNase, par rapport aux cellules qui n'ont reçu aucun traitement RNase. La figure 3 montre comment la modification annexine V / PI protocole, avec fixation et étapes de traitement RNase, améliore les protocoles conventionnels en limitant le nombre d'événements coloration de faux-positifs. Figure 1. Conventionnel protocoles iodure de propidium coloration conduire à un nombre important de faux événements positifs. Nous avons déjà évalué l'étendue de la coloration de faux positifs dans les cellules primaires à travers un large éventail de modèles animaux ainsi que dans une variété de 10 lignées cellulaires. Images représentant montrent l'étendue de coloration de faux positifs dans les trois populations cellulaires uniques (une lignée cellulaire couramment utilisés – les macrophages RAW et deux cellules primaires – les macrophages murins de moelle osseuse (BMM) et les macrophages des poissons rouges rénale primaire (PKM)). Certes les événements positifs attendus afficher le co-localisation entre PI et DRAQ5 dans le compartiment nucléaire (zones jaunes représentent colocalisation entre PI et DRAQ5). DRAQ5 est très membraNE perméables colorant qui précise compartiment colorants nucléaires dans les deux cellules vivantes et mortes 10,11,12. Pour faciliter la détermination visuelle de la colocalisation DRAQ5 tache a été donnée une pseudo couleurs vertes. Figure 2. Améliorer la précision du PI coloration nucléaire. (A) Nous avons évalué la précision de la PI coloration nucléaire basée sur le degré de similitude d'un certain nombre de taches bien caractérisés nucléaire (BrdU, 7-AAD et DAPI) pour DRAQ5. BrdU est un nucléoside synthétique qui est incorporé dans l'ADN des cellules en prolifération, et en tant que tels ne tache dans le compartiment nucléaire. 7-AAD a une forte affinité pour l'ADN et, semblable à PI, ne peut pas traverser une membrane plasmique intacte. DAPI a également une forte affinité pour l'ADN et le nucléaire, le plus couramment utilisé dans la coloration de microscopie à fluorescence. Le degré de similarité était> 99% entre BrdU, 7-AAD, DAPI et DRAQ5, mettant en évidence leur capacité à bien tacher le noyau de la cellule en RAW 264.7 macrophages. En revanche, coloration cytoplasmique PI repose sur des protocoles classiques conduit à une diminution marquée de la similitude pour cent de coloration par rapport à DRAQ5. (B) Des résultats similaires sont observés dans deux cellules primaires testées: les macrophages murins de moelle osseuse (BMM) et les macrophages des poissons rouges rénale primaire (PKM). Incorporation de 50 ug / ml de RNase A au stade spécifique au sein de la procédure de coloration supprime coloration PI non nucléaire et augmente considérablement le degré de similitude par rapport à DRAQ5 coloration. (C) des images représentant des macrophages rénaux primaires montrent le degré de similitude des cellules avec et sans traitement RNase. Pour faciliter la détermination visuelle des différences entre les traitements, DRAQ5 a été donné un vert. Les zones jaunes représentent colocalisation entre BrdU et DRAQ5 et PI et DRAQ5. Figure 3. Mise à jour annexine V / PI réduit significativement l'apoptose fausses / événements nécrotiques. Primaire des macrophages rénaux Goldfish (PKM) ont été colorés avec conventionnels et modifiés annexine V / PI protocoles. Les diagrammes de dispersion illustrent l'annexine V / PI tache dans PKM poissons rouges. Le nuage de points sur la gauche montre conventionnelle annexine V / PI coloration (pas de RNase) des cellules PKM. Le nuage de points sur la droite montre les cellules PKM colorés avec le V modifiés annexine / PI protocole (par la RNase). L'addition de RNase en une réduction marquée de la coloration PI en raison de la suppression des fausses taches de positif. PKM cellules ont ensuite été analysées en fonction des populations distinctes dans les progéniteurs des cultures-précoce (EP), les monocytes (Mono) et les macrophages matures (Mat Mac). La réduction du nombre d'événements positifs PI, en raison de l'enlèvement de faux événements positifs est plus prononcé dans les grandes cellules macrophages matures que dans les petites cellules souches précoces. Les conclusions fondées sur des protocoles classiques aurait tort suggéré une corrélation positive dans la mort cellulaire des sous-ensembles de macrophages plus mature.

Discussion

L'annexine V / PI protocole présenté ici est une version modifiée de protocoles conventionnels et prend en compte la présence d'ARN dans le cytoplasme, qui a également une forte affinité pour les PI. Introduction de la RNase A (50 pg / ml) après une étape de fixation de formaldéhyde à 1% en fin de la procédure de coloration améliore considérablement la précision de la PI coloration nucléaire. Pas d'effets négatifs sont observés dans la PI coloration nucléaire ou de la membrane plasmique annexine V coloration. Sans RNase A de traitement, jusqu'à 40% des résultats de PI tache peut conduire à de faux événements positifs, ce qui conduit à un impact potentiellement significatif et négatif sur les conclusions aval ^10.

Notre protocole de coloration modifiée annexine V / PI est simple et a été utilisé efficacement dans un large éventail de types de cellules (cellules primaires: les macrophages murins de moelle osseuse et des splénocytes; porcine cellules résidentes du poumon, les macrophages pulmonaires alvéolaires, mésentériques isole des ganglions lymphatiques, les leucocytes du sang périphérique , splénocytes, les cellules de blastoderme de poulet; macrophages goldfish rénale primaire; leucocytes du sang périphérique de carpe; lignées cellulaires: les macrophages RAW 264.7, Jurkat cellules T, les macrophages 3D4/31 porcine, le CCA-71 fibroblastes nageoires des poissons rouges, les cellules B 3B11 silure ^10). Il est important de noter que les cellules sont touchés différemment par la coloration PI faux positifs, avec des cellules primaires ayant généralement un plus grand nombre de faux événements positifs ^10. Les différences de coloration de faux positifs parmi PI ces populations cellulaires peut être partiellement attribuée à des différences dans la taille des cellules, mais peut aussi résulter de différences dans le contenu ARN. En tant que tel, l'incorporation de cette procédure est particulièrement pertinent pour les systèmes expérimentaux qui utilisent, entre autres, les cellules subissant un stress génotoxique, les cellules traitées avec des médicaments du cycle cellulaire arrestation tels que la thymidine ou l'hydroxyurée, les cellules infectées viralement, et des études sur les cellules embryonnaires, où la progression développementale est caractérisée par des changements discrets dans la synthèse d'ARN cellulaire.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
1 x PBS-/-
1 x Annexin V Binding Buffer		BD Biosciences	556454
Annexin V-Alexa Fluor 488		Molecular Probes (Invitrogen)	A13201
Propidium iodide (PI)		Sigma-Aldrich	P4864	1 mg/mL in H2O
2% Formaldehyde		Sigma-Aldrich	F1268
RNase A from bovine pancreas		Sigma-Aldrich	R4642
DRAQ5		Biostatus	DR50050	Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-