Summary
세포 죽음의 평가에 대한 정확한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 세포 라인과 동물 모델의 광범위한 범위에서 기본 세포 40 % 허위 - 긍정적인 이벤트까지 표시 기존 Annexin V / propidium 요오드화물 (PI) 프로토콜에 따라이 향상됩니다.
Abstract
세포 apoptosis의 연구는 크게 흐름 cytometry 기반 방법의 도입 이후 영향되었습니다. Propidium 요오드화물의 (PI)가 널리 세포가 플라즈마 막 무결성 및 투자율의 1,2의 차이를 통해 가능한, apoptotic 또는 괴사성 있는지 확인하기 위해 Annexin V와 함께 사용됩니다. Annexin V / PI 프로토콜은 apoptotic 세포에게 3 공부를 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그것이 세포가 4,5 생활 염료를 제외하기 위해 능력을 바탕으로, 경제적 안정과 세포 생존의 좋은 지표이기 때문에 PI는 더 자주 다른 핵 얼룩보다 사용됩니다. 셀 입력 PI의 능력은 막의 투자율에 의존적일 수, PI는 손상 플라즈마 막 1,2,6의 존재로 인해 거주하거나 초기 apoptotic 세포를 얼룩이되지 않습니다. 늦은 apoptotic 및 괴사성 세포에서 플라즈마와 핵 세포막의 무결성은 PI가 세포막을 통과 핵산에 사이에 끼어 넣다, 붉은 형광 1,2,9을 표시할 수 있도록, 7,8을 감소시킵니다. 불행히도, 우리는 그런 기존 Annexin V / PI 프로토콜은 세포질 구획 10 시간 RNA의 PI의 얼룩과 관련된 잘못된 긍정적인 사건의 상당수 (최대 40 %)에 리드 찾습니다. 가장 높은 발생 10보기 : (세포질 비율 <0.5 핵) 기본 세포와 동물 모델의 광범위한 셀 라인은 큰 세포와 영향을받습니다. 여기에, 우리는 기존의 방법에 비해 세포 죽음의 평가에 대한 상당한 개선을 제공하는 수정 Annexin V / PI 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다음과 같은 얼룩 세포에 RNase의 진입을 촉진하기 위해 고정 셀 동안 세포 투과성의 변화에 활용합니다. 타이밍 및 RNase의 농도 모두 세포질 RNA의 제거를 위해 최적화되었습니다. 그 결과 종래의 Annexin V / PI 프로토콜 (세포질 PI의 얼룩과 <5 % 이벤트)을 통해 상당한 개선이다.
Protocol
이 절차는 500 μL siliconized 튜브 또는 6 ML의 폴리스티렌 왕복 하단 외과 튜브에서 수행할 수 있습니다. 다른 절차와 함께 생존 분석을 수행하면 후자가 일반적으로 사용됩니다. 주어진 모든 볼륨 6 ML의 폴리스티렌 왕복 하단 외과 튜브위한 것입니다. 500 μL siliconized 튜브의 경우, 1 / 5 모든 볼륨을 줄일 수 있습니다.
유동세포계측법 분석을위한 최적의 농도는 200 μL 볼륨 당 2-4 X 10 6 세포이다. 셀 손실이 절차에서 발생할 수 있습니다 때문에 우리는 각 예제에서는 프로 시저의 시작 부분에 4 X 10 6 세포로 구성하는 것이 좋습니다.
1. 셀 준비
- 하베스트 세포는 - 해당 셀 라인 기본 셀 isolations에 대한 구체적인 절차를 참조하십시오.
- 10 분 335 X g에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다.
- 2 ML 1 X 인산의 Resuspend 전지 (PBS) 호수 버퍼 - / - (없음 칼슘, 마그네슘 없음).
- 10 분 335 X g에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다.
- 1 ML 일 X Annexin V 바인딩을 버퍼에 셀을 Resuspend.
- 10 분 335 X g에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다.
- 100 μL 1 X Annexin V 바인딩을 버퍼에 Resuspend 세포.
2. Annexin V / PI의 응용 프로그램 스테인
- 제조 업체의 권고에 따라 Annexin V를 추가합니다 [예 : 5 μL Annexin V 알렉사 플루어 488 (분자 프로브, A13201)].
- 실온에서 15 분 어둠 속에 튜브를 품어.
- 각 반응 관 1 X Annexin V 바인딩 버퍼 100 μL를 추가합니다. 각각의 튜브에 약 200 μL이 있어야합니다.
- 1 X Annexin V 구속력 버퍼 (X Annexin V 구속력 버퍼 9 μL 1 즉, 1 μL PI)에 1시 10분 희석되었습니다 PI 4 μL (시그마, 고양이 # P - 4864 - 10ML)를 추가합니다. 이것은 각각의 샘플 2 μg / ML의 최종 PI 농도를 얻을 수 있습니다.
- 실온에서 15 분 어둠 속에 튜브를 품어.
- 세포를 씻어 500 μL 1 X Annexin V 바인딩 버퍼를 추가합니다.
- 10 분 335 X g에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다.
- 500 μL 1 X Annexin V 바인딩 버퍼와 1 %의 포름 알데히드 (정착액) 솔루션을 만들려면 500 μL 2 % 포름 알데히드에 Resuspend 세포. 부드러운 flicking으로 튜브를 섞는다.
- 10 분 얼음에 샘플을 수정. 또한, 샘플은 4 박 저장할 수 있습니다 ° C를 어둠에 약해. 후자의 방법이 선택되면, Annexin V / PI (보상 제어 포함)으로 표시 모든 튜브에 걸쳐 일관되게해야합니다.
- 각 샘플과 flicking에 의해 부드럽게 믹스 - / - 1 ML 1 X PBS를 추가합니다.
- 8 분에 425 X g에서 튜브를 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다.
- 단계 2.10와 2.11를 반복합니다.
- 튜브를 flicking하여 Resuspend 펠릿.
- 50 μg / ML의 최종 농도를 제공 1:100 희석 RNase A (시그마, R4642) 16 μL를 추가합니다. 37 15 분 품어 ° C.
- / - - 1 ML 1 X PBS를 추가하고 flicking으로 가볍게 섞는다.
- 8 분에 425 X g에서 튜브를 원심 분리기.
- 샘플 지금 분석 준비가 된 것입니다. Annexin / PI 염색법 다른 절차를 병렬로 진행되는 경우 또는 샘플이 이후 얼룩 단계에 사용할 수 있습니다.
3. 대표 결과 :
거짓 - 긍정적인 PI의 얼룩의 학위를 가지고 다양한 세포 종류와 세포 라인의 예는 그림 1에 표시됩니다. (그림 2B) RNase의 치료 안 세포에 비해, 거짓 - 긍정적인 이벤트의 수가 크게 감소 거짓 - 긍정적인 이벤트에 대한 계정으로, 세포가 수정되었습니다 다음이 결과를 RNase A. 취급. 그림 2C는 RNase 처리 없었다 세포에 비해 RNase 치료를 받았습니다 세포의 대표 이미지를 보여줍니다. 그림 3은 고정 및 RNase 처리 단계를 통해 수정된 Annexin V / PI 프로토콜, 허위 - 긍정적인 얼룩 이벤트의 수를 제한하여 기존 프로토콜에 따라 개선 방법을 보여줍니다.
그림 1. 기존 propidium의 요오드화물 얼룩 프로토콜은 거짓 긍정적인 사건의 상당수를 얻으실 수 있습니다. 우리는 이전에 동물 모델의 광범위한 걸쳐뿐만 아니라 세포 라인 10의 다양한 기본 세포를 통해 잘못된 긍정적인 얼룩의 정도를 평가합니다. 대표 이미지는 세 독특한 세포 집단 (- RAW macrophages과 두 가지 기본 세포 - murine 골수 macrophages (BMM)와 금붕어 기본 신장 macrophages (PKM) 1 일반적으로 사용되는 세포주)에서 잘못된 긍정적인 얼룩의 범위를 표시합니다. 진정한 긍정적인 이벤트가 핵 구획 내에서 PI와 DRAQ5 사이의 예상 공동 현지화 (노란색 영역 PI와 DRAQ5 사이 colocalization를 묘사)를 표시합니다. DRAQ5 매우 membra입니다NE 투과 염색되는 살고 죽은 세포 10,11,12 모두 정확하게 얼룩 핵 구획. colocalization DRAQ5보다 쉽게 시각 결정을위한 얼룩은 녹색 pseudocolour을 받았다.
그림 2. PI 핵 얼룩의 정확성을 향상. (A) 우리는 DRAQ5을 잘 특징 핵 얼룩의 숫자 (BrdU, 7 - AAD 및 DAPI)의 유사성의 정도에 따라 PI 핵 얼룩의 정확성을 평가. BrdU는 proliferating 세포의 DNA에 통합하고, 같은 오직 핵 구획 내에 착색하는 합성 뉴클레오입니다. 7 - AAD는 손상 플라즈마 막을 통과하지 못하면, PI와 비슷한 높은 DNA에 대한 친화력과을 가지고 있습니다. DAPI는 DNA에 대한 강한 친화력을 가지고 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 핵은 형광 현미경에 얼룩 있습니다. 유사성의 정도가 정확하게 RAW 264.7 macrophages의 세포 핵을 얼룩이 자신의 능력을 강조, BrdU, 7 - AAD, DAPI와 DRAQ5 사이> 99%되었다. 대조적으로, 기존의 프로토콜을 기반으로 세포질 PI의 얼룩은 DRAQ5에 상대적으로 얼룩의 %의 유사성에 표시된 감소로 연결됩니다. murine 골수 macrophages (BMM)와 금붕어 기본 신장 macrophages (PKM) (B)와 마찬가지로 결과는 테스트를 두 가지 기본 세포에서 관찰됩니다. 50 μg / ML RNase 얼룩 절차 내의 특정 단계에서의 결합이 아닌 핵 PI의 얼룩을 제거하고 크게 DRAQ5 얼룩에 상대적 유사성의 정도를 증가시킵니다. (C) 기본 신장 macrophages의 대표 이미지와 RNase 처리없이 세포에 대한 유사성의 정도를 보여줍니다. 트리 트먼트 차이보다 쉽게 시각 결정을위한, DRAQ5는 녹색을 받았다. 노란색 영역은 BrdU와 DRAQ5, 그리고 PI와 DRAQ5 사이 colocalization을 묘사.
그림 3. 수정 Annexin V / PI 크게 잘못된 apoptosis / 괴사성 이벤트를 줄여줍니다. 기본 금붕어 신장 macrophages (PKM)는 종래와 수정 Annexin V / PI 프로토콜 물들일되었습니다. Scatterplots는 Annexin V / PI는 금붕어 PKM에 얼룩 묘사. 왼쪽 scatterplot는 PKM 세포의 일반적인 Annexin V / PI 염색법을 (NO RNase)를 보여줍니다. 오른쪽 scatterplot은 수정 Annexin V / PI 프로토콜 (RNase)를 물들일 PKM 세포를 보여줍니다. 거짓 긍정적인 얼룩의 제거에 의한 PI의 얼룩이 표시된 감소 RNase 결과뿐만 아니라. PKM 세포 그런 다음 서로 다른 문화 - 초기 progenitors 이내에 인구 (EP), monocytes (모노)와 성숙 macrophages (매트 MAC)를 기반으로 분석했다. 거짓 긍정적인 사건의 제거로 인해 긍정적인 PI 이벤트의 수가 감소가 작은 초기 전구 세포보다 큰 성숙 세포 대식 세포의 세포에 더 많은 발음입니다. 기존의 프로토콜에 따라 결론이 잘못보다 성숙한 대식 세포의 하위 집합에 대한 세포의 죽음에 긍정적인 상관 관계를 제안 것입니다.
Discussion
Annexin V / PI 프로토콜 여기서 제시하는 것은 기존 프로토콜의 수정된 버전이며 계정으로 또한 PI에 대한 높은 친화력을 가지고있는 세포질에서 RNA의 존재를 걸립니다. 얼룩 절차 후반 1 %의 포름 알데히드 고정 단계 다음 RNase (50 μg / ML)의 소개 원자력 PI의 얼룩의 정확도를 크게 향상시킵니다. 대한 부정적인 영향은 핵 PI의 얼룩이나 플라즈마 막 Annexin V의 얼룩에서 관찰되지 않습니다. RNase 치료없이 얼룩 PI 결과의 최대 40 %가 하류 결론 10 잠재적으로 중요하고 부정적인 영향에 이르게 거짓 긍정적인 행사로 이어질 수 있습니다.
우리 수정 Annexin V / PI 염색법 프로토콜은 간단하고 세포 유형 (기본 세포의 광범위한 범위에서 효과적으로 사용되었습니다 murine 골수 macrophages 및 splenocytes, 돼지 폐 재류 세포, 폐 폐포 macrophages, mesenteric 림프 노드 격리, 말초 혈액 leukocytes , splenocytes, 닭고기 배반엽 세포, 금붕어 기본 신장 macrophages, 잉어 말초 혈액 leukocytes, 셀 라인 : RAW 264.7 macrophages, Jurkat T 세포, 돼지 3D4/31 macrophages, CCL - 71 금붕어 지느러미 섬유아 세포, 3B11 메기의 B 세포 10). 세포가 differentially 차 전지는 일반적으로 잘못된 긍정적인 이벤트 10 큰 숫자를 가지고와 잘못된 긍정적인 PI의 얼룩에 의해 영향됩니다하는 것이 중요합니다. 이 세포 집단 간의 차이를 거짓 긍정적인 PI의 얼룩은 부분적으로 셀 크기의 차이로 표시될 수 있습니다뿐만 아니라 RNA 내용의 차이에서 발생할 수 있습니다. 이 절차의 예, 결합은 다른 사람 사이에 활용할 실험 시스템, genotoxic 스트레스를 겪고 세포, 세포주기 체포 등 thymidine 또는 hydroxyurea와 같은 약물, virally 감염된 세포 및 발달 진행 배아 세포 연구로 치료 세포에 특히 관련으로 세포 RNA 합성의 이산 변화이 특징입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 자연 과학 및 캐나다 (NSERC) 연구 부여 공학 의회와 DRB하는 앨버타 농업 기금 컨소시엄 부여에 의해 지원되었다. AMR은 NSERC 베니 캐나다 대학원 장학금, 앨버타 교육 assistantship와 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금의 대학을 통해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x PBS-/- | |||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
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